實驗三 細菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術(shù)

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1、實驗三細菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術(shù)一、實驗?zāi)康???(1)了解和學(xué)習(xí)水中細菌總數(shù)和大腸菌群的測定原理和測定意義。???(2)學(xué)習(xí)和掌握用稀釋平板計數(shù)法測定水中細菌總數(shù)的方法。???(3)學(xué)習(xí)和掌握水中大腸菌群的檢測方法。二、實驗原理???水的微生物學(xué)的檢驗，特別是腸道細菌的檢驗，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時也是評價水質(zhì)狀況的重要指標(biāo)。國家飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，飲用水中大腸菌群數(shù)每升中不超過3個，細菌總數(shù)每mL不超過100個。它反映的是檢樣中活菌的數(shù)量。???所謂大腸菌群，是指在37℃24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌的總稱。水的大腸菌群數(shù)是指10

2、0mL水檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實際數(shù)值，以大腸菌群最近似數(shù)(MPN)表示。水源中大腸菌群的數(shù)量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項重要指標(biāo)。目前，國際上已公認大腸菌群的存在是糞便污染的指標(biāo)。因而對飲用水必須進行大腸菌群的檢查。???水中大腸菌群的檢驗方法，常用多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法可運用于各種水樣的檢驗，但操作繁瑣，需要時間長。濾膜法僅適用于自來水和深井水，操作簡單、快速，但不適用于雜質(zhì)較多、易于阻塞濾孔的水樣。三、實驗材料1、菌落總數(shù)的測定：1)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，無菌生理鹽水。2)器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管等。2、大腸菌群

3、的測定：???1)培養(yǎng)基：???①乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)基：???蛋白胨20g，膽鹽(或牛、羊膽鹽)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。???制法：將蛋白胨、膽鹽、乳糖溶于水中，校正pH，加入指示劑，分裝，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一個杜氏小管，121℃滅菌15min。???②伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基：制法：將伊紅美藍瓊脂粉溶于水中，校正pH后分裝．121℃滅菌15min備用。平板劃線法：接種是采用平板劃線的方法將初發(fā)酵的大腸桿菌進行接種。3四、實驗方法1、水樣的采集：???1)自來水：先將自來水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌，再開放水龍頭使水

4、流5min，以滅菌三角瓶接取水樣以備分析。???2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸邊5m處，取距水面10-15cm的深層水樣，先將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。如果不能在2h內(nèi)檢測的，需放入冰箱中保存。2、細菌總數(shù)的測定：???1)水樣稀釋及培養(yǎng)：①按無菌操作法，將水樣作10倍系列稀釋；?②根據(jù)對水樣污染情況的估計，選擇2-3個適宜稀釋度(飲用水如自來水、深井水等，一般選擇1、1:10兩種濃度；水源水如河水等，比較清潔的可選擇1:10、1:100、1:1000三種稀釋度；污染水—被選擇1:100、1

5、:1000、1:10000三種稀釋度)，吸取1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作3個重復(fù)。???③將熔化后保溫度45℃的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒平皿，每皿約15mL，并趁熱轉(zhuǎn)動平皿混合均勻。???④待瓊脂凝固后，將平皿倒置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±1h后取出，計算平皿內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得1mL水樣中所含的細菌菌落總數(shù)。???2)計算方法：???作平板計數(shù)時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。?3)計數(shù)的報告：???選取菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)。一個稀釋度使用兩個重復(fù)時，應(yīng)選取兩個平

6、板的平均數(shù)。如果一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板計數(shù)作為該稀釋度的菌數(shù)。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，可計算半個平板后乘2以代表整個平板的菌落數(shù)。???細菌的菌落數(shù)在l00以內(nèi)時，按其實有數(shù)報告；大于100時，用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)字，以四舍五入方法修約。為了縮短數(shù)字后面的0的個數(shù)，可用10的指數(shù)來表示。?3、大腸菌群的測定(多管發(fā)酵法)：???①初步發(fā)酵試驗：3???在10支裝有10mL的乳糖膽鹽的發(fā)酵試管中(內(nèi)有倒置小管)，以無菌操作各加入稀釋后的水樣1mL。搖勻后，37℃培養(yǎng)24h。???②平板分離：

7、???經(jīng)24h培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管(瓶)，分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板(EMB培養(yǎng)基)上，37℃培養(yǎng)18—24h。大腸菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略帶有或不帶有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深；挑取符合上述特征的菌落進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。?③復(fù)發(fā)酵試驗：?將革蘭氏陰性無芽胞桿菌的菌落的剩余部分接于單倍乳糖發(fā)酵管中，為防止遺漏，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的平板上同類型菌落1—3個，37℃培養(yǎng)24h，如果產(chǎn)酸又產(chǎn)氣者，