實(shí)驗(yàn)五土壤中細(xì)菌純種分離和培養(yǎng)

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1、實(shí)驗(yàn)五土壤中細(xì)菌分離、純化和培養(yǎng)一、目的要求1、初步掌握從土壤中分離和純化細(xì)菌的基本方法。2、練習(xí)微生物接種和培養(yǎng)的基本技術(shù)，掌握無菌操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理土壤是微生物生活的大本營(yíng)，是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應(yīng)用潛力的微生物的主要菌源。不同土樣中各類微生物數(shù)量不同，一般土壤中細(xì)菌數(shù)量最多。用挑單孢法、稀釋涂布平板法或平板劃線法獲得一種或一株微生物。三、儀器和材料樣品：新鮮土壤培養(yǎng)基：滅菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基無菌水：帶有玻璃珠裝有90mL無菌水三角瓶、裝有9mL無菌水的試管。其它：無菌培養(yǎng)皿(直徑75毫米)、無菌玻璃移液管、酒精燈、培養(yǎng)箱等

2、。四、操作步驟細(xì)菌純種分離的方法有兩種：1、稀釋平板法2、平板劃線法（一）細(xì)菌純種分離的操作方法（1）取樣選擇較肥沃的土壤，鏟去表土層，挖5-20cm深度的或特殊要求的地方土壤，裝入滅過菌的袋內(nèi)，封好袋口，做好編號(hào)記錄，攜回實(shí)驗(yàn)室供分離用。1、稀釋平板分離法（2）制備土壤稀釋液◆將1瓶90mL和7管9mL的無菌水排列好，按10-2、10-3、10-4、10-5及10-6依次編號(hào)?！舴Q取土樣10g放入盛90mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，用手搖10min，使土樣均勻分散，制成（10-1）土壤懸液。◆在無菌操作條件下，用lmL無菌移液管

3、吸取lmL10-1濃度的菌液于另一管9mL無菌水中，將移液管吹洗三次，搖勻即為10-2濃度菌液?！敉瑯臃椒ǎ来蜗♂尩?0-6。注意：在土壤稀釋過程中，吸取不同梯度的菌液需換用不同的吸管。①吸取菌液：用無菌移液管吸取菌液于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。注意：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻。（3）平板的制作注意：在無菌培養(yǎng)皿底部注明稀釋度。②倒平板：?將融化并冷至約50℃的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)。?將培養(yǎng)皿平放在桌上，順時(shí)針和反時(shí)針來回轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板（每組制培養(yǎng)皿3套）。③對(duì)照取“對(duì)照”的

4、無菌培養(yǎng)皿，倒平板待凝固后，打開皿蓋10min后蓋上皿蓋。（1）平板的制作將融化并冷至約50℃的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，使凝固成平板。2、平板劃線分離法（2）劃線用接種環(huán)挑取一環(huán)土壤懸液，左手拿培養(yǎng)皿，中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，將培養(yǎng)皿稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀半開，右手將接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板上輕輕劃線（每組做三皿）。注意：切勿劃破培養(yǎng)基劃線的方式可取圖中任何一種1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法（二）培養(yǎng)將前面制作的平板倒置于培養(yǎng)箱，30℃培養(yǎng)24～48h，然后觀察結(jié)果。

5、（三）挑菌純化在平板上選擇分離較好的有代表性的單菌落接種斜面，如果不純，需進(jìn)一步挑取此菌落采取稀釋平板法或劃線分離法分離，直至獲得純培養(yǎng)。分離平板制備土壤稀釋液時(shí)，要注意使土樣均勻分散在稀釋液中。注意無菌操作。平板劃線要注意染菌，同時(shí)注意劃線深度和密度。五、注意事項(xiàng)六、思考題1．分離土壤中的細(xì)菌時(shí)為什么要稀釋？2．用一根無菌移液管接種幾種濃度的水樣時(shí)，應(yīng)從哪個(gè)濃度開始？為什么？3．如何檢驗(yàn)平板上某個(gè)單菌落是不是純培養(yǎng)？