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《土壤中細(xì)菌純種分離和培養(yǎng)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、實(shí)驗(yàn)七土壤中細(xì)菌純種分離和培養(yǎng)一、目的要求掌握從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥、垃圾、堆肥等）中初步分離培養(yǎng)細(xì)菌的方法，從而獲得細(xì)菌純培養(yǎng)技能；了解基本接種技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理土壤是微生物生活的大本營(yíng)，是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應(yīng)用潛力的微生物的主要菌源。不同土樣中各類微生物數(shù)量不同，一般土壤中細(xì)菌數(shù)量最多；其次為放線菌和霉菌。一般在較干燥、偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富的土壤中放線菌數(shù)量較多；酵母菌在一般土壤中的數(shù)量較少，而在水果表皮、葡萄園、果園土中數(shù)量多些。本次實(shí)驗(yàn)從土壤中分離細(xì)菌。為了分離和確保獲得某種微生物的單菌落，首先要考慮制備不同稀釋度的菌懸液。各類菌的
2、稀釋度因菌源、采集樣品時(shí)的季節(jié)、氣溫等條件而異。其次，應(yīng)考慮各類微生物的不同特性，避免菌源中各類微生物的相互干擾。要想獲得某種微生物的純培養(yǎng)，還需提供有利于該微生物生長(zhǎng)繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。微生物四大類菌的分離培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間見表所示。三、儀器和材料樣品：新鮮土壤培養(yǎng)基：滅菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基無(wú)菌水：帶有玻璃珠裝有90mL無(wú)菌水三角瓶、裝有9mL無(wú)菌水的試管。其它：無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌吸管、酒精燈、培養(yǎng)箱等。四、細(xì)菌純種分離的操作方法細(xì)菌純種分離的方法有兩種：平板劃線法和澆注平板法。（一）平板劃線分離法1．平板的制作將融化并
3、冷至約50℃的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，使凝固成平板。每組制培養(yǎng)皿3套。 在無(wú)菌培養(yǎng)皿底部注明分離菌名、稀釋度。用接種環(huán)挑取一環(huán)土壤懸液，左手拿培養(yǎng)皿，中指、無(wú)名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，將培養(yǎng)皿稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀半開，右手將接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板上輕輕劃線（切勿劃破培養(yǎng)基），劃線完畢蓋好皿蓋，倒置，30℃培養(yǎng)24-48h后觀察結(jié)果。2．操作劃線的方式可取圖中任何一種1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法（二）澆注平板法1．采土樣選擇較肥沃的土壤，鏟去表土層，挖5-20cm深度的或特殊要
4、求的地方土壤數(shù)10g，裝入滅過(guò)菌的牛皮紙袋內(nèi)，封好袋口，做好編號(hào)記錄，攜回實(shí)驗(yàn)室供分離用。2．制備土壤稀釋液將1瓶90mL和4管9mL的無(wú)菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4及10-5依次編號(hào)。稱取土樣10g放入盛99mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，置搖床振蕩5min使土樣均勻分散在稀釋液中成為土壤懸液（10-1），在無(wú)菌操作條件下，用lmL無(wú)菌移液管吸取lmL10-1濃度的菌液于一管9mL無(wú)菌水中，將移液管吹洗三次，搖勻即為10-2濃度菌液。同樣方法，依次稀釋到10-5。注意：在土壤稀釋過(guò)程中，吸取不同梯度的菌液需換用不同
5、的吸管。3．平板的制作取10套無(wú)菌培養(yǎng)皿編號(hào)，10-3、10-4、10-5各3個(gè)，另1個(gè)為空氣對(duì)照。取1支lmL無(wú)菌移液管從濃度小的10-5菌液開始，以10-5、10-4、10-3為序分別吸取0.5mL菌液于相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿內(nèi)（注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻）。加熱融化培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)基冷至45℃左右時(shí)，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指、無(wú)名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，靠近火焰，將皿蓋掀開，倒入培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿平放在桌上，順時(shí)針和反時(shí)針來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于30
6、℃培養(yǎng)24-48h，然后觀察結(jié)果。取“對(duì)照”的無(wú)菌培養(yǎng)皿，倒平板待凝固后，打開皿蓋10min后蓋上皿蓋，倒置于30℃培養(yǎng)24-48h后觀察結(jié)果。土壤稀釋液的制備和稀釋液的取樣五、微生物的幾種接種技術(shù)操作由于實(shí)驗(yàn)的目的、所研究的微生物種類、所用的培養(yǎng)基及容器的不同，因此，接種方法也有多種，現(xiàn)簡(jiǎn)介如下：（－）接種用具常用的接種用具有接種環(huán)、接種針、接種鉤、玻璃刮刀、鏟、移液管、滴管等。接種環(huán)和接種針等總長(zhǎng)約25cm，環(huán)、針、鉤的長(zhǎng)為4.5cm，可用白金、電爐絲或鎳絲制成。上述材料以白金絲最為理想，其優(yōu)點(diǎn)是在火焰上灼燒紅得快，離火焰后冷得快，不易氧
7、化且無(wú)毒。但價(jià)格昂貴，一般用電爐絲和鎳絲。接種環(huán)的柄為金屬的，其后端套上絕熱材料套。柄也可用玻璃捧制作。（二）接種環(huán)境微生物的分離培養(yǎng)、接種等操作需在經(jīng)紫外線燈滅菌的無(wú)菌操作室、無(wú)菌操作箱或生物超凈臺(tái)等環(huán)境下進(jìn)行。（三）幾種接種技術(shù)1．斜面接種技術(shù)是將長(zhǎng)在斜面培養(yǎng)基（或平板培養(yǎng)基）上的微生物接到另一支斜面培養(yǎng)基上的方法。（l）接種前將桌面擦凈，將所需的物品整齊有序地放在桌上。（2）將試管貼上標(biāo)簽，注明菌名、接種日期、接種人等相關(guān)信息。（3）點(diǎn)燃酒精燈。（4）將一支斜面菌種和一支待接的斜面培養(yǎng)基放在左手上，拇指壓住兩支試管，中指位于兩支試管之間
8、，斜面向上，管口齊平。（5）右手先將棉塞擰松動(dòng)，以便接種時(shí)拔出。右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)燒紅以達(dá)到滅菌（環(huán)以上凡是可能進(jìn)入試管的部分都應(yīng)灼燒）。（6）在火焰旁，用
