基因工程重組人干擾素

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1、根據(jù)來源、基因序列和氨基酸組成分類I型干擾素：IFNα、IFNβ、IFNτ、IFNω來源：白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、病毒感染的組織細(xì)胞等功能：抗病毒感染、抗腫瘤生長免疫調(diào)節(jié)(較弱）其中IFN-α為多基因產(chǎn)物，有23種以上的亞型。II型干擾素：干擾素γ（IFNg)來源：活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生功能：免疫調(diào)節(jié)?提高單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的抗原提呈能力?增強(qiáng)Tc細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷活性?抑制TH2細(xì)胞形成，下調(diào)體液免疫應(yīng)答?趨化作用?抗病毒和抗腫瘤作用（次要）2.根據(jù)動(dòng)物來源確定分類，例如人干擾素（HuIFN），小鼠干擾素（MuIFN）。免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在對宿主免疫細(xì)胞活性的影響，如對巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞

2、、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等均有一定作用。l對巨噬細(xì)胞的作用：IFNγ可使巨噬細(xì)胞表面MHCⅡ類分子的表達(dá)增加，增強(qiáng)其抗原遞呈能力；此外還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞表面表達(dá)Fc受體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬免疫復(fù)合物、抗體包被的病原體和腫瘤細(xì)胞。l對淋巴細(xì)胞的作用：干擾素對淋巴細(xì)胞的作用較為復(fù)雜，可受劑量和時(shí)間等因素的影響而產(chǎn)生不同的效應(yīng)。在抗原致敏之前使用大劑量干擾素或?qū)⒏蓴_素與抗原同時(shí)投入會(huì)產(chǎn)生明顯的免疫抑制作用；而低劑量干擾素或在抗原致敏之后加入干擾素則能產(chǎn)生免疫增強(qiáng)的效果。在適宜的條件下，IFNγ對B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的分化有促進(jìn)作用，但不能促進(jìn)其增殖。IFNγ能增強(qiáng)TH1細(xì)胞的活性，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能；但對TH

3、2細(xì)胞的增殖有抑制作用，因此抑制體液免疫功能。IFNγ不僅抑制TH2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，而且抑制IL-4對B細(xì)胞的作用，特別是抑制B細(xì)胞生成IgE。l對其它細(xì)胞的作用：IFNγ對其他細(xì)胞也有廣泛影響：①刺激中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬能力；②活化NK細(xì)胞，增強(qiáng)其細(xì)胞毒作用；③使某些正常不表達(dá)MHCⅡ類分子的細(xì)胞（如血管內(nèi)皮細(xì)胞、某些上皮細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞）表達(dá)MHCⅡ類分子，發(fā)揮抗原遞呈作用；④使靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對中性粒細(xì)胞的粘附能力更強(qiáng)，且可分化為高內(nèi)皮靜脈，吸引循環(huán)的淋巴細(xì)胞。二重組干擾素的臨床應(yīng)用l廣譜抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。l直接抗腫瘤活性（rhu

4、IFNα）毛細(xì)胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。l免疫調(diào)節(jié)活性——治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFNγ）l多發(fā)性硬化癥rhuIFNβ對已知基因序列的干擾素,基因文庫的調(diào)用可以用其序列3'端和5'端部分事先用同位素標(biāo)記過的序列作為探針,通過雜交的方法進(jìn)行調(diào)用。由于干擾素基因的種屬特異性不是很大,

5、可以用人的干擾素基因?yàn)橥刺结?從鼠基因文庫中調(diào)出相應(yīng)的干擾素基因,其方法將在下文1中提到。

6、對于擾素基因的取用,不僅可以使用構(gòu)建基因文庫的方法,對已了解其氨基酸或核昔酸割成的干擾素也可以用化學(xué)合成的方法先合成其編碼的DNA序列,再對其進(jìn)行表達(dá)?；瘜W(xué)合

7、成方法包括固相合成法及液相合成法兩

8、大類。與利用基因文庫的方法相比,化學(xué)合成法比較

9、復(fù)雜,由于每加入一個(gè)核昔酸就會(huì)有一定比例的錯(cuò)誤摻入、基因重疊、基因缺失等情況,并且在l整個(gè)合成過程中這種錯(cuò)誤不斷積累,因此該方法適合比較短的基因,而對長的基因則有目的產(chǎn)

10、物含量低、產(chǎn)物純化困難的缺點(diǎn)。但它也有優(yōu)點(diǎn),如可根據(jù)研究的需要對一些氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)

11、突變,或根據(jù)宿主菌的特性,在不改變其氨基酸組成的情況下使用宿主的偏愛密碼子,以提高

12、產(chǎn)物的產(chǎn)量。

13、對于不同亞型的干擾素,由于同源性較高,可以用相同的引物從誘導(dǎo)的小鼠細(xì)胞系中提取mRNA混合物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增,然后用亞型特異性探針對CDNA混合物進(jìn)行Southern印跡,這樣便可將序列上相差較小的同

14、種、不同亞型的干擾素基因進(jìn)行分離,為生產(chǎn)高純度的單一干擾素提供了方法O三、表達(dá)方法隨著對干擾素研究的深入,人們了解到鼠干擾素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上的10~40位、78~107位、123~166位的A、B、C區(qū),尤其是位于78和79位的氨基酸對抗病毒

15、活性十分重要。而人IFNt1的121~136位對抗病毒活性作用較大,人IFN子的N端10個(gè)集

16、基酸也是保持其活性所必需的。對干擾素結(jié)構(gòu)的了解為更好地構(gòu)建基因表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。干

17、擾素最初是用其外源序列進(jìn)行表達(dá)的,但近年來的研究表明嵌合表達(dá)的干擾素往往優(yōu)于單一干擾素,因此出現(xiàn)了較多的嵌合表達(dá)形式,并取得了較好的效果。1.IFN-α的表達(dá)家蠶作

18、為一種用于表達(dá)外源基因的宿主有易于養(yǎng)殖、生產(chǎn)周期短、夕陽基因表達(dá)量高的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)由于家蠶為真核生物,能對表達(dá)產(chǎn)物自行進(jìn)行糖基化修飾,產(chǎn)生有生物活性的蛋白,并且在產(chǎn)物提取的過程中只要將家蠶進(jìn)行勻漿,再進(jìn)行抽提即可,操作上十分方便,因此,它在基因工程領(lǐng)域內(nèi)被廣泛應(yīng)用。下面便以人IFN,α的生產(chǎn)為例介紹家蠶表達(dá)體系在干擾素生產(chǎn)中的應(yīng)用。用家蠶核型多角病毒BIIINPV體外感染的家蠶傳代細(xì)胞株BM-N通過