生化科技研究所微生物與細(xì)胞專題討論

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1、生化科技研究所微生物與細(xì)胞專題討論題目:DevelopingAspergillusasahostforheterologousexpression作者：DavidLubertozzi,JayD.Keasling文章來源：BiotechnologyAdvances27(1):53-75,2009演講人：Ming-YuehWu吳明玥D99B22005指導(dǎo)老師：Prof.Ching-TsanHuang黃慶璨教授演講日期：October4,2010演講地點：The6thClassroom摘要麴菌(Aspergillus)是一種極具潛力之異源表現(xiàn)宿主(heterologouse

2、xpressionhost)，包含許多經(jīng)濟(jì)菌種，廣泛地被應(yīng)用於許多研究中。然而，與酵母菌或細(xì)菌相較，麴菌之基因工程工具套組(toolkit)發(fā)展相當(dāng)緩慢，除因其本身之複雜性外，投入之研究資源也較少。本文針對以麴菌作為表達(dá)宿主之研究歷史及現(xiàn)況進(jìn)行回顧，並對未來可能之研究方向進(jìn)行討論。Keywords：Aspergillus、Heterologous、Expression、Secondarymetabolites前言?本研究之重要性麴菌屬相當(dāng)龐大，涵蓋許多知名且重要之種類。麴菌可生長於相當(dāng)廣範(fàn)圍之溫度、酸鹼度、水活性及滲透壓中生長(1)，並可持續(xù)外泌大量之代謝物至培養(yǎng)基(

3、2)，其絲狀形態(tài)使菌體可藉簡單過濾就與產(chǎn)物分離。因此，麴菌被廣泛應(yīng)用於穀物及飲品之固態(tài)醱酵及工業(yè)酵素之生產(chǎn)。由於麴菌具高應(yīng)用潛力，許多相關(guān)研究紛紛開始進(jìn)行，如部分物種之基因體解碼(3-8)、以及超過300種基因被發(fā)現(xiàn)，提供研究者上百種突變株進(jìn)行研究。隨著penicillin及aflatoxin生合成路徑的發(fā)現(xiàn)，刺激了二次代謝物之研究進(jìn)展，對於麴菌對環(huán)境之影響有了更多了解。如同其他真菌，麴菌與高等生物具有高度之基因相似性，不僅有哺乳類細(xì)胞之蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯、摺疊及轉(zhuǎn)譯後修飾特性，也具備原核生物之簡易培養(yǎng)之特性，因此更適合作為重組蛋白質(zhì)之表現(xiàn)宿主。為促進(jìn)麴菌之應(yīng)用性，提升特定產(chǎn)

4、物產(chǎn)量或移除其毒性，品系改良(strainimprovement)為相當(dāng)重要之工作，目前多利用隨機(jī)突變及單一代謝物產(chǎn)量篩選之方式進(jìn)行。?前人作過的研究一、麴菌轉(zhuǎn)形策略由於多細(xì)胞形態(tài)、厚質(zhì)細(xì)胞壁及質(zhì)體之缺乏，使得麴菌轉(zhuǎn)形策略難以發(fā)展，目前最常用之策略為原生質(zhì)體轉(zhuǎn)形法、電穿孔法、基因槍法及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)形法。由於麴菌常用於生產(chǎn)食用或醫(yī)用產(chǎn)物，故許多營養(yǎng)篩選標(biāo)記被開發(fā)以提升其安全性。麴菌轉(zhuǎn)形過程中，基因多以非同源性插入基因體(9)，一般而言，轉(zhuǎn)形株通常帶有1~10套插入基因，且相當(dāng)穩(wěn)定。但非同源性插入常導(dǎo)致許多問題，如致死、表現(xiàn)量不佳或其他表現(xiàn)型改變等等。故許多同源性基因插入策略

5、因應(yīng)而生，如以致死基因反向篩選、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)形等。二、麴菌基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)多數(shù)麴菌基因含有內(nèi)含子(intron)，其3’及5’截切點與酵母菌具高保守性，然而在酵母菌表現(xiàn)時卻無法被正確截切。這可能是因轉(zhuǎn)錄前及轉(zhuǎn)錄後修飾，也可能是因轉(zhuǎn)譯抑制或活化所致(10,11)。麴菌之控制元件(controlelement)多數(shù)已被定義，其CCAAT啟動子結(jié)合區(qū)與多數(shù)真核生物具有高保守性。麴菌之基因調(diào)控可主要分做廣域調(diào)控(wide-domainregulation)，如二次代謝物生產(chǎn)，及途徑專一性調(diào)控(pathway-specificregulation)，如產(chǎn)孢等。此外，麴菌具有基因群(g

6、enecluster)之構(gòu)造，其在染色體上之位置對於基因調(diào)控影響甚鉅。三、麴菌異源表現(xiàn)為增強(qiáng)麴菌異源表現(xiàn)效能，融合輸送片段(fusioncarrier)外泌策略及蛋白酶剔除等品系改良策略均被應(yīng)用。此外，不同啟動子策略亦應(yīng)用於不同需求，如產(chǎn)量調(diào)控、表現(xiàn)時間調(diào)控、可誘導(dǎo)或回饋抑制，或與宿主代謝途徑可交互作用等。此外，3’非轉(zhuǎn)譯區(qū)及5’非轉(zhuǎn)譯區(qū)也會影響轉(zhuǎn)譯效能。麴菌之複雜基因調(diào)控使其可因應(yīng)不同環(huán)境切換代謝途徑，故調(diào)控培養(yǎng)條件可影響其產(chǎn)率。而在基因?qū)蛹墎砜?，基因插入位置與宿主之高表現(xiàn)量基因位置愈接近，產(chǎn)能亦愈高?；虿迦胩讛?shù)與表現(xiàn)量並無一定關(guān)係，部分多套數(shù)轉(zhuǎn)形株具有高活性，部

7、分卻會導(dǎo)致基因靜默(silencing)。儘管麴菌可大量表現(xiàn)真菌蛋白質(zhì)，但非真菌蛋白質(zhì)之產(chǎn)率仍低，可能是因轉(zhuǎn)譯效率低、mRNA前修飾不正確及mRNA穩(wěn)定性差所致。前二者可能與密碼子偏好及5’非轉(zhuǎn)譯區(qū)有關(guān)，後二者則可能與融合輸送片段有關(guān)。麴菌之外泌策略相當(dāng)重要，除利用菌絲多分支菌株外，亦可融合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)指向序列(ER-targetingsequence)及提升轉(zhuǎn)醣基酶(glycosyltransferase)活性以提升外泌效力。此外，利用未折疊蛋白質(zhì)效應(yīng)(unfoldedproteinresponse,UPR)提升伴隨體(chaperone)及折疊酶(fo