資源描述：
《生物化學(xué)第14章核酸的物理化學(xué)性質(zhì)和第15章核酸的研究方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、第14章核酸的物理化學(xué)性質(zhì)(Physicalandchemicalpropertiesofnucleicacid)一、核酸的水解二、核酸的酸堿性質(zhì)三、核酸的紫外吸收四、核酸的變性、復(fù)性及雜交一、核酸的水解核酸可被水解的位點(diǎn)有磷酸酯鍵和糖苷鍵，其中糖苷鍵更易被水解。核酸的酸水解嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵對(duì)酸更不穩(wěn)定，對(duì)酸最不穩(wěn)定的是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵。DNA在pH1.6于37℃對(duì)水透析可完全除去嘌呤堿；在pH2.8于100℃加熱1h，也可完全除去嘌呤堿。為了水解嘧啶糖苷鍵，需要較高的溫度。用
2、甲酸（98%～100%）密封加熱至175℃2h，無(wú)論RNA或DNA都可以完全水解，產(chǎn)生嘌呤堿和嘧啶堿，缺點(diǎn)是尿嘧啶的回收率較低。改用三氟乙酸在155℃加熱60min（對(duì)DNA）或80min（對(duì)RNA），嘧啶堿的回收率顯著提高。核酸的堿水解RNA的磷酸酯鍵易被堿水解，產(chǎn)生核苷酸。DNA的磷酸酯鍵則不易被堿水解。這是因?yàn)镽NA的核糖上有2’－OH，在堿作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯極不穩(wěn)定，隨即水解，產(chǎn)生核苷2’，3’－環(huán)磷酸酯。該環(huán)磷酸酯繼續(xù)水解產(chǎn)生2’－核苷酸和3’－核苷酸。DNA一般對(duì)堿穩(wěn)定，若在1m
3、ol/LNaOH中加熱至100℃4h，可以得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。RNA的堿水解核酸的酶水解水解核酸的酶種類(lèi)很多。非特異性水解磷酸二酯鍵的酶為磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。專(zhuān)一水解核酸的磷酸二酯酶稱為核酸酶。另外還有非特異水解糖苷鍵的糖苷酶。核酸酶的分類(lèi)Ⅰ按底物專(zhuān)一性分類(lèi)：作用于RNA的稱為RNA酶（ribonuclease，RNase）；作用于DNA的稱為DNA酶（deoxyribonuclease，DNase）。按對(duì)底物作用的方式可分為核酸內(nèi)切酶（endonuclease）和核
4、酸外切酶（exonuclease）。少數(shù)核酸酶既可內(nèi)切又可外切。核酸酶的分類(lèi)Ⅱ按磷酸二酯鍵斷裂的方式可將核酸酶分為兩類(lèi)，一類(lèi)斷裂磷酸二酯鍵后磷酸保留在5’位，一類(lèi)磷酸保留在3’位。作用于雙鏈的為雙鏈酶，作用于單鏈的為單鏈酶。核酸外切酶有5’→3’方向切割的，也有3’→5’方向切割的，分別稱為5’→3’外切酶和3’→5’外切酶。還有對(duì)特定核苷酸序列部位進(jìn)行切割的（限制性內(nèi)切酶）。二、核酸的酸堿性質(zhì)堿基的解離Ⅰ胞嘧啶的解離堿基的解離Ⅱ尿嘧啶的解離胸腺嘧啶的解離堿基的解離Ⅲ腺嘌呤的解離鳥(niǎo)嘌呤的解離核苷的解離
5、核苷中由于戊糖的存在，堿基的解離常數(shù)有所下降，說(shuō)明糖的存在增強(qiáng)了堿基上可解離基團(tuán)的酸性。核苷酸的解離核酸中磷酸基的解離核苷酸的解離曲線Ⅰ核苷酸的解離曲線Ⅱ尿苷酸的堿基的堿性極弱，實(shí)際上測(cè)不出其含氮環(huán)的解離曲線，故不能形成兼性離子。小牛胸腺DNA的滴定曲線從中間往兩邊滴為曲線Ⅰ，非緩沖區(qū)較寬。從兩邊往中間滴為曲線Ⅱ，非緩沖區(qū)較窄。這種情況是DNA雙鏈分子解鏈導(dǎo)致的三、核酸的紫外吸收嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，使堿基、核苷、核苷酸、核酸在240～290nm有強(qiáng)烈的吸收，最大吸收值在260nm附近。紫外吸收
6、是實(shí)驗(yàn)室中最常用的定量測(cè)定DNA或RNA濃度的方法。對(duì)于純的樣品，只要測(cè)出260nm的A值即可計(jì)算出濃度。通常A值為1相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA，或40μg/ml單鏈DNA或RNA。測(cè)定紫外吸收值還可以鑒定核酸溶液的純度。純DNA的A260/A280應(yīng)大于1.8，純RNA應(yīng)達(dá)到2.0。若低于此值說(shuō)明含有雜質(zhì)。四種核苷酸的紫外吸收曲線摩爾磷吸光系數(shù)有時(shí)核酸溶液的紫外吸收以摩爾磷的吸光度來(lái)表示。摩爾磷即相當(dāng)于摩爾核苷酸。先測(cè)定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩爾磷吸光系數(shù)。式中A為測(cè)得的吸光度
7、，c為磷的濃度，L為比色杯的厚度，W為每升溶液中磷的重量（克）。DNA的增色效應(yīng)和減色效應(yīng)一般天然DNA的ε(P)為～6600，RNA為7700～7800。單鏈核酸的ε(P)比雙鏈核酸的大，核苷酸單體的ε(P)更大。雙鏈DNA變性成單鏈后ε(P)值增大，稱為增色效應(yīng)；復(fù)性后ε(P)值減小，稱為減色效應(yīng)。這是因?yàn)殡p鏈結(jié)構(gòu)使堿基對(duì)的π電子云發(fā)生重疊，減少了對(duì)紫外光的吸收。DNA的紫外吸收光譜1.天然DNA2.變性DNA3.核苷酸總吸光度值四、核酸的變性、復(fù)性及雜交核酸的變性核酸的變性就是雙鏈之間的氫鍵斷裂
8、，成為單鏈。變性主要是雙鏈DNA變成單鏈，也可以是單鏈RNA分子內(nèi)的局部雙鏈變成單鏈。使核酸變性的因素有高溫、過(guò)酸過(guò)堿、變性劑等。常用的核酸變性劑有尿素、甲醛。DNA變性示意圖DNA分子的熔點(diǎn)Tm在DNA分子的熱變性中，隨著溫度的升高，當(dāng)溫度達(dá)到一定值后，雙鏈開(kāi)始解開(kāi)，然后有一個(gè)迅速的解鏈，成為無(wú)規(guī)線團(tuán)，變性的溫度區(qū)間很窄，我們把雙鏈DNA解開(kāi)一半時(shí)所需的溫度稱為該DNA的熔點(diǎn)（Tm）。DNA的Tm一般在82～95℃之間。DNA分子的熱變性曲線DNA分子
