應(yīng)用PicoGreen熒光染料進(jìn)行DNA精確定量

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1、應(yīng)用PicoGreen熒光染料進(jìn)行DNA精確定量關(guān)鍵詞:Picogreen熒光染料DNA定量DNA精確定量點擊:1380作者:原平皓生物簡介：對微量的雙鏈DNA進(jìn)行定量在各種生物學(xué)應(yīng)用中都顯得非常重要,例如cDNA文庫的構(gòu)建；用于亞克隆的DNA片段的純化；定量DNA擴(kuò)增產(chǎn)物,在藥物中DNA分子殘留的測定等。檢測核酸濃度最常用的方法就是檢測核酸在260nm(A260)處的光吸收，這一方法主要的缺點是單鏈核苷酸和單核苷酸會產(chǎn)生干擾信號，核酸樣品中的雜質(zhì)也會影響結(jié)果。光吸收不能區(qū)分DNA和RNA,靈敏度也相對較低(用1cm的比色杯在A26

2、0值為0.1時相對應(yīng)的雙鏈DNA濃度為5μg/ml)。Picogreen染料是一種新型的dsDNA染料：其檢測靈敏度高，可檢測到pg級DNA；檢測范圍寬，可跨越４個數(shù)量級；特異性好，基本不受ssDNA和RNA的影響，并且可以耐受一定濃度的鹽、尿素、乙醇、氯仿、去垢劑、蛋白等干擾。目前使用Picogreen染料定量檢測DNA已經(jīng)廣泛用于生物學(xué)檢測，并被2010年版《中華人民共和國藥典》選為藥物殘留DNA定量方法。原理：檢測方法：2．所需器材lModulusTM單管型多功能檢測儀（9200-003）l微量適配器（9200-928）l微量

3、比色皿lPicoGreen試劑3．試驗方案3.1試劑準(zhǔn)備PicoGreen是以1mL的濃縮液形式保存在無水的DMSO（二甲基亞砜）中。實驗當(dāng)天，配制2×PicoGreen試劑的工作溶液，用1×TE按1:200的比例稀釋濃縮液（10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH7.5）。如果要準(zhǔn)備足夠的工作溶液測定20個樣品，可在20mL1xTE中加入100μLPicoGreendsDNA定量試劑。由于試劑容易吸附到玻璃表面，要在塑料容器中配制。PicoGreen試劑見光易降解，所以應(yīng)將配好的溶液用箔包住或放置暗處避光保存。溶液最好在配制

4、好數(shù)小時內(nèi)使用，以保證最佳結(jié)果。3.2DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線3.2.1標(biāo)準(zhǔn)品工作液的配制：Sigama小牛胸腺嘧啶DNA干粉（貨號：D4522-1MG）1mg（Tris，Nacl等濃度已成標(biāo)準(zhǔn)體系），加入1mL雙蒸水，配制成1mg∕mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液；3.2.2標(biāo)準(zhǔn)品工作液稀釋：（1）母液稀釋：取10ul（1mg∕mL）標(biāo)準(zhǔn)品工作液加入到990ulTE溶液中，濃度稀釋成10ug∕mL，取10ul（10ug∕mL）標(biāo)準(zhǔn)品工作液加入到990ulTE溶液中，濃度稀釋成100ng∕mL；（2）倍比稀釋：取800ul（100ng∕mL）的標(biāo)準(zhǔn)品工作液

5、加入到200ulTE溶液中，濃度達(dá)到80ng∕mL（藥典規(guī)定：熒光染色方法DNA含量在1.25-80ng/mL范圍線性較好,該法DNA檢出限為0.3ng/ml），取500ul（80ng∕mL）的標(biāo)準(zhǔn)品工作液加入到500ulTE溶液中，濃度稀釋到40ng∕mL；依次倍比稀釋，配成20ng/ml、10ng/ml、5.0ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；3.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：倍比稀釋后的各梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液和染料工作液各取100ul混勻，避光室溫放置5min。3.2.4使用ModulusT

6、M單管型多功能檢測儀的Blue熒光模塊檢測樣品的熒光值：將混合后的溶液加入微量比色皿，確信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測皿的外部，可以驅(qū)散氣泡。以1×TE緩沖液為blank，測定樣品和空白對照的熒光值；用標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度（ng/ml）對應(yīng)的熒光強(qiáng)度作直線回歸，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線4樣品分析在每個樣品中加入等體積的2×PicoGreen工作溶液（3.1節(jié)準(zhǔn)備），充分混勻，避光于室溫下孵育5分鐘。將孵育好的溶液加入微量比色皿，使用ModulusTM單管型多功能檢測儀檢測其熒光值。將樣品溶液的熒光強(qiáng)度代入回歸方程，求出樣品的殘余DNA含量

7、（ng/ml）。