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1、一、HBVDNA熒光定量PCR技術(shù)（一）標本血清、血漿（其它如組織細胞、乳汁、精子、尿液等體液）；標本應(yīng)封閉保存，特別在夏季，如果標本暴露的過久，開蓋保存，很容易出現(xiàn)水分蒸發(fā)，檢測結(jié)果和上一次的檢測結(jié)果會有較大的差異。環(huán)境條件影響不大，比如保存在-8°、-20°、24°、還是室溫，對高中低病毒含量的最后的檢測結(jié)果影響不是太大，只要封閉保存就可以。因此可常溫運輸，但不可泄露。（二）檢測方法國內(nèi)最常使用PEG（聚乙二醇方法）法進行核酸提取，采用TaqMan探針進行熒光PCR擴增。擴增40循環(huán)進行結(jié)果分析，如下圖一所示：典型的雙S形的曲線圖，越早出現(xiàn)熒光曲線的病
2、毒含量越高，越晚越低。根據(jù)不同的梯度的四個標準品進行定量。如果血清或標本里面沒有病毒，就是一個陰性直線。最近我們在徹底解決污染問題之后采用擴增50個循環(huán)的方法。優(yōu)點是讓擴增管里的反應(yīng)液充分反應(yīng)，缺點是如果實驗室存在一個潛在的污染或操作人員操作習(xí)慣不好，很容易出現(xiàn)攜帶污染，造成假陽性。對實驗室的來說不應(yīng)該通過減少擴增的循環(huán)數(shù)來解決污染問題，而應(yīng)該通過科學(xué)的管理，提高試劑的質(zhì)量，以及養(yǎng)成一個良好的操作習(xí)慣，或防污染的習(xí)慣來解決假陽性的問題。增加循環(huán)數(shù)有利于標本檢測結(jié)果的判斷，這將來可能是實驗室發(fā)展的一個趨向。COBASTaqMan技術(shù)在我們國家已經(jīng)有好多實驗室
3、有這種全自動的核酸提取擴增系統(tǒng)，它的優(yōu)勢重點在于檢測病毒含量比較低的血清標本，但是對于病毒含量比較高的，往往出現(xiàn)熒光PCR競爭的缺點。圖一為：PCR擴增曲線（三）污染的預(yù)防與排除PCR擴增產(chǎn)物污染是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題，所以擴增區(qū)的儀器如槍頭等要注意。最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝,因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。標本處理區(qū)，包括擴增摸板的制備；PCR擴增區(qū)
4、，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴增；產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。切記:產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。（四）常用儀器常用的PCR儀器：ABI系列、羅氏系列、安捷倫系列、國產(chǎn)SLAN等。（五）臨床意義檢測血清或血漿HBVDNA陽性有什么臨床意義？1.判斷血清中是否有HBVDNA的存在我們檢測到的HBVDNA包括完整HBV病毒和DN
5、A片段。目前我們用的HBVDNA熒光PCR法，還不能區(qū)分是完整病毒還是片段。只要檢測到的病毒載量在檢測線以上就可以定為標本含有HBVDNA。2.判斷抗病毒療效的評估指標細胞內(nèi)HBVDNA和HBVDNA確認方法。病人采用各種抗病毒藥物，比如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋或替米夫定等抗病毒藥物，因為這些藥可以有效的抑制病毒復(fù)制，用藥之前或用藥之后，病人的血清里或外周血白細胞里是不是還有病毒的存在？病毒下降了多少？是不是有病毒的反彈？這是臨床醫(yī)生關(guān)心的問題。隨著抗病毒藥物用藥時間的延長，有些病人血清里面的HBVDNA一直處于檢測線以下。因此目前臨床醫(yī)生有一些新的需
6、求，就是能不能確認病人血清里究竟有沒有HBVDNA。不同的實驗室報告檢測低限值不一樣，有的實驗室報<1000IU，有的實驗室報<100IU，COBASTaqMan<12個，<12個還是有病毒，血清里究竟有多少個？是臨床急需的一種HBVDNA確認方法。即確認血清里面究竟有沒有病毒?，F(xiàn)在已經(jīng)提出一種檢測方法。3.HBVDNA陽性與傳染性感染乙肝病毒必須達到一定的量，突破各種屏障（血液里的補體、細胞因子、抗體等），進入肝細胞復(fù)制，才能達到傳染性的要求，因此并不是接觸到病毒都會被感染。HBeAg的產(chǎn)生與意義→HBeAg與HBVDNA清除的不平衡帶來的異常模式→HB
7、sAg的包裹與剪切（完整HBV形成）→不同形式HBsAg的產(chǎn)生與意義。抗HBc、抗HBe和抗HBs的產(chǎn)生。四，HBVDNA定量與乙肝血清學(xué)模式不同組合的意義。大三陽（表面抗原、E抗原和核心抗體陽性）并抗HBs陽性：HBsAg/IgM。E抗原陽性說明病人體內(nèi)的乙肝病毒處于一種活躍性的復(fù)制狀態(tài)。這時有的病人合并表面抗體的陽性，是不是獲得一定的抵抗力？不是。表面抗體往往是病毒復(fù)制時誘發(fā)了機體免疫答應(yīng)而產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，這個抗體是針對表面抗原的IgM大蛋白抗體。因此它是機體對乙肝病毒復(fù)制免疫反抗的結(jié)果。這時要提高病人或保持病人的免疫功能；小三陽并抗HBs陽性：病毒活
8、動性復(fù)制、不同型病毒的感染等；抗HBs或抗HBc與HBVDNA同時
