T細(xì)胞體外培養(yǎng)

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1、目前應(yīng)用于臨床的治療的T細(xì)胞有如下幾種：1、CD3AK細(xì)胞CD3AK細(xì)胞全稱為抗CD3單克隆抗體激活的殺傷細(xì)胞，當(dāng)淋巴細(xì)胞與抗CD3單克隆抗體共育2-3天，淋巴細(xì)胞可以明顯增殖，此種激活為一次性完成，淋巴細(xì)胞一經(jīng)激活即無需抗CD3單克隆抗體持續(xù)存在而發(fā)揮作用。只會(huì)在加入低劑量的IL-2繼續(xù)培養(yǎng)即可維持起活躍增殖，經(jīng)2-3周培養(yǎng)后可獲得大量的表現(xiàn)為CD3+、CD4以及CD8+的混合體，且隨時(shí)間延長，CD3+和CD8+雙陽性細(xì)胞的比例增加，而CD4+和CD8+雙陽性的比例則下降。因此，CD3AK細(xì)胞在表型上似乎接近于CTL。具體培養(yǎng)方法:1、培養(yǎng)前1天以含CD3Ab5mg

2、／L的磷酸鹽緩沖液(PBS)20ml平鋪培養(yǎng)瓶，4℃過夜包被；2、培養(yǎng)第1天棄去PBS，以PBS沖洗2次及1640培養(yǎng)液沖洗1次，加入1000U／ml的IFN-γ，置于37℃體積分?jǐn)?shù)為5％C02的飽和濕度培養(yǎng)箱中；3、24小時(shí)后加入1000U／ml的lL-2。4、繼續(xù)培養(yǎng)2、CIK細(xì)胞CIK細(xì)胞的全稱為細(xì)胞因子活化的殺傷細(xì)胞，它是在多種細(xì)胞因子（IFN-γ，CD3單抗，CD28單抗，IL-2和IL-1）作用下，外周血單核細(xì)胞可以被定向誘導(dǎo)并大量增殖成為具有抗腫瘤活性的細(xì)胞群。CIK細(xì)胞的表型主要為CD3+CD56+,是來源于PBMC中的T細(xì)胞（CD3+CD56-）。具

3、體培養(yǎng)方法：3、LAK細(xì)胞LAK細(xì)胞全稱為淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞，可在外周血單核細(xì)（PBMC）中加入IL-2體外培養(yǎng)4-6天，能誘導(dǎo)出一種非特異的殺傷細(xì)胞，稱為LAK細(xì)胞。LAK細(xì)胞的前體細(xì)胞是NK細(xì)胞和T細(xì)胞。4、TIL細(xì)胞TIL細(xì)胞的全稱為腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞。它的制備方法與LAK細(xì)胞相似，所不同的是TIL的細(xì)胞來源是腫瘤組織中分離的浸潤淋巴細(xì)胞，用少量的IL-2細(xì)胞刺激后，能大量擴(kuò)增表型為CD4+及CD8+為主的T細(xì)胞。外周血單核細(xì)胞（PBMC）分離實(shí)驗(yàn)血標(biāo)本：EDTA（2%）鹽抗凝血：采集后可4度保存不超過半天，盡量早處理。10ml抗凝血分2份（分離淋巴細(xì)胞可稍多

4、）。外周血單核細(xì)胞（PBMC）分離步驟：1.吸出10ml新鮮抗凝血（含2%EDTA）至50ml離心管中，加入10mlPBS混勻，此時(shí)共20ml；2.2個(gè)50ml離心管內(nèi)分別加入10ml外周血單核細(xì)胞（PBMC）分離分層液；3.向裝有分層液的50ml的離心管分別加入10ml稀釋樣品，注意緩慢加入，不要沖破液面，2000r/min離心20分鐘；4.巴氏管插入液面，輕吸灰白色的淋巴細(xì)胞層，放入另一個(gè)離心管中，避免吸入分層液和血漿（2管混入一個(gè)離心管）；5.加入5mlPBS，1800r/min離心5分鐘；6.棄上清，取沉淀，再次加入5mlPBS混勻成細(xì)胞懸液，1000r/mi

5、n離心5分鐘，棄去上清，保留沉淀;7.2ml1640培養(yǎng)基重懸后移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)需要購買的試劑：外周血淋巴細(xì)胞分離液、anti-CD3抗體、IL-2、IL-1、IFN-γ。