淀粉酶活力的測定

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1、淀粉酶活力測定一、實驗?zāi)康囊运Y選出的芽孢桿菌為實驗菌株，通過種子擴大培養(yǎng)，選出生長力旺盛的菌株進行液體搖瓶發(fā)酵。通過測定不同發(fā)酵時間生產(chǎn)的酶活，來初步估計發(fā)酵最佳時期和終點。通過本實驗要掌握測定酶活的方法。二、實驗原理淀粉酶是能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。芽孢桿菌主要用來產(chǎn)生α-淀粉酶和異淀粉酶，其中α-淀粉酶又稱淀粉1，4-糊精酶，能夠切開淀粉鏈內(nèi)部的α-1，4-糖苷鍵，將淀粉水解為麥芽糖、含有6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖與DNS試劑

2、共熱呈陽性反應(yīng)，產(chǎn)生紅棕色；而異淀粉酶又稱淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支鏈淀粉分子分枝點處的α-1，6-糖苷鍵，將支鏈淀粉的整個側(cè)鏈切下變成直鏈淀粉。通過發(fā)酵實驗，我們可以以酶活為依據(jù)，初步估計發(fā)酵的最佳時期和發(fā)酵終點。酶活力也稱酶活性，是以酶在最適溫度、最適pH等條件下，催化一定的化學(xué)反應(yīng)的初速度來表示。本實驗是以一定量的淀粉酶液，于37°C、pH6.8的條件下，在一定的初始作用時間里將淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖，然后通過與DNS試劑作用，比色測定，求得還原糖的生成量，從而計算出酶反應(yīng)

3、的初速度，即酶的活力。這里規(guī)定，一個淀粉酶活力單位定義為在37°C、pH6.8的條件下，每分鐘水解淀粉生成1mg還原糖所需的酶量。三、實驗材料及設(shè)備1、篩選出來的產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌。2、菌種：從商丘師院土壤中分離出的產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌3、種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%,酵母浸出物0.5%,氯化鈉1%,pH自然4、發(fā)酵培養(yǎng)基：按正交試驗所選的最佳方案來配置5、儀器：控溫搖床、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、分光光度計、燒杯、玻璃棒、錐形瓶、離心機、刻度試管：25mL×4、容量瓶：100mL×1、燒杯：250mL×

4、1、滴管2支、洗耳球2支、洗瓶、試管架、移液管架、移液管、玻棒：各1支四、試劑的配制1、培養(yǎng)基的配制按上述配方稱量、溶解、滅菌2、淀粉溶液（0.5%）稱取5g可溶性淀粉，溶于1000mL熱水中。（臨用前配制）蔗糖溶液（1%）3、3,5-二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）將5.0g3,5-二硝基水楊酸溶于200mL2NNaOH溶液中（不適宜用高溫促溶），接著加入500mL含130g酒石酸鉀鈉的溶液，混勻。再加入5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解后，定容至1000mL。暗處保存?zhèn)溆谩?、磷酸緩沖液（0.

5、2mol/L，pH6.8）5、NaOH溶液（6mol/L）6、NaCl溶液（0.3%）五、操作步驟1、淀粉酶的制備(1)菌的培養(yǎng)菌種活化：將保存的菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24h,備用。種子液的制備：取一環(huán)活化的菌種,接入裝量為50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,37℃,180r/min培養(yǎng)18h。搖瓶培養(yǎng)：分別取1mL種子液,接入盛有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的200mL三角瓶中(接種量為2%,V/V)。置搖床中,30℃振蕩培養(yǎng)24h,轉(zhuǎn)速為160r/min（2）酶的提?。阂后w培養(yǎng)基在300

6、0r/min的離心機中離心10min，取上清；2、淀粉酶活力的測定取25mL刻度試管4支，按下表編號并操作，記錄實驗結(jié)果。管號試劑（ml）1234pH6.8緩沖液1212蔗糖溶液11淀粉溶液11淀粉酶液11酶促反應(yīng)搖勻，37℃水浴5minDNS試劑2顯色反應(yīng)沸水浴5min光密度（D540）六、結(jié)果處理根據(jù)上表的實驗結(jié)果，以蔗糖濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標繪制出標準曲線。α-淀粉酶活性由下式求得：A=（500×f/m）×〔100/（100-h）〕×（lgD1-lgD2）/（t1-t2）=500×

7、f·b/m）×〔100/（100-h）〕式中：A──α-淀粉酶活性；m──100mL氯化鈣提取的試樣質(zhì)量，g；h──試樣中水分含量，％；f──酶提取液的稀釋倍數(shù)；t1、t2──不同的反應(yīng)時間，min；D1、D2──時間t1、t2時的吸光度；b──lgD對t的曲線的斜率的絕對值；500──系數(shù)。