《讓質(zhì)粒鮮活起來》PPT課件

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1、讓質(zhì)粒鮮活起來生物技術(shù)102班第二小組成員：華璐、鐘依依、苗舒、莊思靜、章輝輝質(zhì)粒的概念質(zhì)粒是一類亞細胞有機體，結(jié)構(gòu)比病毒還要簡單，既沒有蛋白質(zhì)外殼，也沒有細胞外的生命周期，卻能在宿主細胞中獨立地增值，并隨著宿主細胞的分裂而被遺傳下去。Plasmid目錄CONTENTS基本性質(zhì)主要類型提取方法異同分析質(zhì)粒的基本性質(zhì)質(zhì)粒分子的構(gòu)型多樣、大小不一1質(zhì)粒的自主復(fù)制性和可擴增性2質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性3質(zhì)粒的不相容性4質(zhì)粒分子的構(gòu)型多樣、大小不一共價封閉環(huán)狀DNA，即SC構(gòu)型。開環(huán)DNA，稱作OC構(gòu)型。線形DNA，即L構(gòu)型123除了酵母的殺傷質(zhì)粒是一種RNA質(zhì)粒外，目前發(fā)現(xiàn)的

2、質(zhì)粒都是以DNA方式存在的。質(zhì)粒的自主復(fù)制性和可擴增性根據(jù)質(zhì)粒復(fù)制與宿主菌相關(guān)程度不同，可將質(zhì)粒分為嚴謹型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒（常被選為基因工程載體）嚴謹型質(zhì)粒通常是一些具有自身傳遞能力的大質(zhì)粒，其復(fù)制與宿主菌密切相關(guān)。松弛型質(zhì)粒通常是分子量較小，不具傳遞能力的質(zhì)粒，它在宿主菌內(nèi)通?？珊?0-200個拷貝，且不受宿主菌蛋白合成的影響。質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性是指質(zhì)粒從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞的特性。根據(jù)是否攜帶控制細菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，質(zhì)?？煞譃榻雍闲唾|(zhì)粒和非接合型質(zhì)粒兩類。質(zhì)粒的不相容性質(zhì)粒的不相容性有時也稱質(zhì)粒的不親和性，它是指在沒有選擇壓力的情況

3、下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能在同一個宿主細胞系中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象，這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。No.1主要依賴天然存在的質(zhì)粒No.2人工構(gòu)建一批分子量相對較小、拷貝數(shù)較多、具特殊功能的質(zhì)粒載體No.3主要借助于一些輔助序列引入新的功能質(zhì)粒研制與發(fā)展的三個階段常用的幾種質(zhì)粒pBR322質(zhì)粒載體這是目前常規(guī)基因克隆實驗中最普遍采用的載體，有萬能質(zhì)粒之稱。pUC質(zhì)粒載體它實際上是由pBR322質(zhì)粒載體改造而來的一系列質(zhì)粒載體的總稱。它包括有pUC8、pUC9、pUC12、pUC13、pUC18等。PvuⅡ2067pBR322質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)圖pUC18質(zhì)粒載體結(jié)

4、構(gòu)圖pUC系列質(zhì)粒載體的優(yōu)點與pBR322質(zhì)粒載體相比，pUC系列質(zhì)粒載體具有許多優(yōu)越性：（1）具有更小的分子量和更高拷貝數(shù)。（2）由于具有來自大腸桿菌lac操縱子lacZ’的基因，它所編碼的α肽鏈可參與α互補作用，可用于組織化學(xué)方法檢測重組體。（3）具有多克隆位點MCS區(qū)段。質(zhì)粒的提取在提出的許多用于從細菌中提純質(zhì)粒DNA的方法中都含有以下3個步驟:（1）細菌培養(yǎng)物的生長。（2）細菌的收獲和裂解（3）質(zhì)粒DNA的純化。提取的方法質(zhì)粒DNA的提取方法主要有：堿裂解法（此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列分析）煮

5、沸法酚氯仿裂解法。堿裂解法1.接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細胞于2mlLB培養(yǎng)基。2.37℃振蕩培養(yǎng)過夜。3.取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。4.加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/LEDTApH8.0，25mM/LTris-HClpH8.0)充分混合。5.加入0.2ml溶液II(0.2mM/LNaOH，1％SDS)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5min。6.加入0.15m1預(yù)冷溶液III(5mol/LKAc，pH4.8)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5min。7.以10，000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管8.加入等體積的

6、異戊醇，混勻后于0℃靜置10min。9.再以10，000rpm離心20min，棄上清。10.用70％乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。11.待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE緩沖液中相關(guān)試劑的作用（一）溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0主要作用是：調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH，使大腸桿菌懸浮于反應(yīng)液中，螯合Ca2+、Mg2+等二價金屬離子。（二）溶液II，0.2NNaOH/1%SDS主要作用是：兩者共同作用，使細胞溶解（其中NaOH為主，SDS為輔）。（三）溶液III，3M醋酸鉀/2M醋酸主要作用是：使鉀離子置換SDS中的鈉離子

7、而形成不溶性的PDS，同時高濃度的鹽，使得沉淀更加完全。（四）異戊醇主要作用是：為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。（五）乙醇主要作用是：進一步沉淀質(zhì)粒DNA，去除殘留的鹽。質(zhì)粒提取基因組提取提取步驟基本上都屬DNA的提取步驟，包括細胞裂解，DNA釋放，純化，最后沉淀溶解提取中有一個DNA變性、復(fù)性的過程，整個過程較為簡單，用時短。沒有DNA變性、復(fù)性的過程，對有些革蘭氏陽性菌要進行溶菌酶處理，整個過程更復(fù)雜，耗時更長。與基因組提取的異同Thankyou!