原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)方法

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1、神經(jīng)細胞培養(yǎng)體外神經(jīng)細胞的培養(yǎng)已成為神經(jīng)生物學(xué)研究中十分有用的技術(shù)手段。神經(jīng)細胞培養(yǎng)的主要優(yōu)點是:(1)分散培養(yǎng)的神經(jīng)細胞在體外生長成熟后,能保持結(jié)構(gòu)和功能上的某些特點,而且長期培養(yǎng)能形成髓鞘和建立突觸聯(lián)系,這就提供了體內(nèi)生長過程在體外重現(xiàn)的機會。(2)能在較長時間內(nèi)直接觀察活細胞的生長、分化、形態(tài)和功能變化,便于使用各種不同的技術(shù)方法如相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、同位素標(biāo)記、原位雜交、免疫組化和電生理等手段進行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化學(xué)和生物因子（如神經(jīng)營養(yǎng)因子）等實驗條件,觀

2、察條件變更對神經(jīng)細胞的直接或間接作用。(4)便于從細胞和分子水平探討某些神經(jīng)疾病的發(fā)病機制，藥物或各種因素對胚胎或新生動物神經(jīng)細胞在生長、發(fā)育和分化等各方面的影響。我們實驗室從80年代始開展了神經(jīng)細胞的體外培養(yǎng)工作，取得了一些經(jīng)驗，現(xiàn)將培養(yǎng)細胞分類及方法簡要介紹如下:一.雞胚背根神經(jīng)節(jié)組織塊培養(yǎng)主要用于神經(jīng)生長因子（NGF）等神經(jīng)營養(yǎng)因子的生物活性測定。在差倒置顯微鏡下觀察以神經(jīng)突起的生長長度和密度為指標(biāo)半定量評估NGF的活性。1．材料和方法（1）選正常受精的雞蛋，置于37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)孵化，每日翻動雞蛋一次。（2）取孵化8

3、-12d的雞蛋,用70%酒精消毒蛋殼，從氣室端敲開蛋殼，用消毒鑷剝除氣室部蛋殼。（3）用彎鑷鉤住雞胚頸部，無菌條件下取出雞胚置小平皿內(nèi)，除去頭部后，腹側(cè)向上置滅菌毛玻璃片上,用眼科彎鑷子打開胸腹腔，除去內(nèi)臟器官。（4）在解剖顯微鏡下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其兩側(cè)，在椎間孔旁可見到沿脊柱兩側(cè)排列的背根節(jié)（圖1），用一對5號微解剖鑷小心取出。（5）置背根節(jié)于解剖溶液內(nèi)，用微解剖鑷去除附帶組織，接種于涂有鼠尾膠的玻璃或塑料培養(yǎng)瓶中，在DMEM無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)。2．結(jié)果雞胚背根神經(jīng)節(jié)在含神經(jīng)生長因子(NGF,2.5S，20ng/

4、ml)的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h,神經(jīng)節(jié)長出密集的神經(jīng)突起。而未加NGF的神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)24h,未見神經(jīng)突起生長。二．新生大鼠、新生小鼠及雞胚背根神經(jīng)節(jié)分散細胞培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)（DRG）細胞起源于神經(jīng)嵴，NGF研究先驅(qū)Levi-Montalcini的實驗表明，外原性NGF能刺激DRG細胞生長發(fā)育并形成廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在體外，分離培養(yǎng)的神經(jīng)節(jié)在NGF存在的情況下，神經(jīng)突起的生長在一天之內(nèi)可長達數(shù)毫米，因此，利用培養(yǎng)的DRG細胞，進行軸突生長發(fā)育的研究，是最為經(jīng)典而常用的方法之一。1．材料和方法取新生一天的大鼠(wistar種)和小鼠

5、(昆明種)。用眼科剪在無菌條件下除去背部皮膚,然后剪取一段脊髓,背側(cè)朝上置于滅菌毛玻璃片上,在解剖顯微鏡下沿椎管兩側(cè)水平剪除腹側(cè)一半椎骨,暴露脊髓和神經(jīng)節(jié),用解剖鑷分離出神經(jīng)節(jié)。雞胚背根神經(jīng)節(jié)的取材方法同前。剝除神經(jīng)節(jié)被膜,用0.125%胰蛋白酶消化(37℃30min)分散后用種植(Plating)培養(yǎng)液稀釋成0.2×105個細胞/ml密度的細胞懸液，接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中,每皿2ml細胞懸液置。置標(biāo)本于36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液，改用飼養(yǎng)(Feeding)培養(yǎng)液培養(yǎng)。接

6、種第3d,在培養(yǎng)皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神經(jīng)細胞的增殖,作用48h后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液，以后每周換液兩次,每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。82.培養(yǎng)液成份種植培養(yǎng)液:80%Eagle'sDMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO33.7g/L);10%胎牛血清;10%馬血清;NGF20ng/ml;谷氨酰胺100μg/ml。脫氧核糖核酸酶I40μg/ml。飼養(yǎng)培養(yǎng)液:95%Eagle'sDMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO33.7g/L,)

7、；5%馬血清；NGF20ng/ml；神經(jīng)營養(yǎng)素1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml。3．新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元接種后4h,大部分細胞可貼壁,呈圓形或橢圓形,直徑8-14μm,胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈。神經(jīng)元的細胞核位于中央或偏于胞體一側(cè),核仁明顯,亦可見雙核神經(jīng)元。接種后24h,大部分貼壁細胞開始長出突起。其中多數(shù)為具有多個突起的多極神經(jīng)元,少數(shù)為雙極和假單極神經(jīng)元,突起細長,并可觀察到突起末端的生長錐。除單個散布的神經(jīng)元外,還常見到幾個或多個神經(jīng)元聚集在一起,它們向四周發(fā)出樹枝狀的

8、神經(jīng)突起。培養(yǎng)2-3d后神經(jīng)元的突起逐漸增多并延長,形成稀疏的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。隨著培養(yǎng)時間的延長,神經(jīng)元突起的主干和分枝明顯延長并增粗,神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得更加稠密,神經(jīng)元胞體逐漸增大。大鼠背根節(jié)神經(jīng)元可維持培養(yǎng)2個月。4．新生小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征新生小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長