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《原代細(xì)胞培養(yǎng)與分離》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、原代細(xì)胞的培養(yǎng)與建系凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。細(xì)胞的純化或細(xì)胞克隆技術(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)工作的基礎(chǔ)。第一節(jié)原代細(xì)胞的取材人和動物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件，直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)。一、取材的基本要求.1．取材要注意新鮮和保鮮.2．應(yīng)嚴(yán)格無菌.3．防止機(jī)械損傷.4．去除無用組織和避免干燥.5．應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等.6．作好記錄二、各類組織的取材技術(shù)皮膚和粘膜的取材內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材血液細(xì)胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材動物組織取材人胚體組織取材雞（鴨）鳥
2、類胚胎組織取材雞（鴨）鳥類胚胎組織取材皮膚和粘膜的取材.主要取自于手術(shù)過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般2~4平方厘米。內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材.內(nèi)臟除消化道外基本是無菌的，但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實(shí)體瘤取材時要取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締組織。血液細(xì)胞的取材.血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等）分離細(xì)胞，取材時應(yīng)注意抗凝。骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材.嚴(yán)格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，
3、用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。動物組織取材.1、鼠胚組織取材.首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后（注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內(nèi)，影響組織活力），取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。.2、幼鼠胚
4、腎（或肺）取材.幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開至兩側(cè)：然后采用無菌法打開胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開游離并拉向兩側(cè)，然后采用無菌法從背部打開腹腔取腎。人胚體組織取材.取材方法與鼠類相同雞（鴨）鳥類胚胎組織取材步驟.（1）取孵化至適當(dāng)胚齡（9~12天）的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運(yùn)動的胚蛋，說明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。.（2）將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干；.（3）經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用
5、無菌法用剪刀或中號鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；.（4）用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚；.（5）用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。第二節(jié)原代細(xì)胞的分離和制作.人或動物體內(nèi)（或胚胎組織）由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來。一、懸浮細(xì)胞的分離方法.組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。二、實(shí)體組織材料的
6、分離方法.對于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。（一）機(jī)械分散法.方法:.特點(diǎn):簡便、快速,但對組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。（二）消化分離法.組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后
7、，細(xì)胞容易貼壁生長。1．酶消化分離法.酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶.胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開。影響胰蛋白酶作用的主要因素.細(xì)胞類型.酶的活力.酶的濃度.溫度.pH.無機(jī)鹽離子.消化時間膠原酶（Collagenase）消化法.膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶，對膠原有很強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用。表4-1胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別項(xiàng)目胰蛋白酶膠原酶消化特性適
8、用于消化軟組織適用于消化纖維多的組織用量0.01%～0.5%0.1～0.3mg/mL(200u/mL)消化時間0.5～2小時（小塊）1～12小時pH8～96.5～7.0作用強(qiáng)度強(qiáng)烈緩和細(xì)胞影響時間過長有影響無大影響血清、鈣、鎂離子有影
