資源描述：
《雞胚原代細胞培養(yǎng).doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、雞胚原代細胞培養(yǎng)[實驗材料]9～10日齡雞胚，Hank"s液50mL，0．5％水解乳蛋白液或MEM培養(yǎng)液20mL(內含犢牛血清1mL，雙抗0．2mL，pH7．2)，O．25％胰蛋白酶5mL、7％NaHC031mL，手術剪，鑷子，滅菌的培養(yǎng)皿，50mL三角瓶，滴管若干，鏈霉素小空瓶若干(加入細胞懸液培養(yǎng)用)，高壓滅菌塞子若干，培養(yǎng)盤，蛋座，95％酒精，水浴鍋。[實驗內容及操作程序]1．配液制備細胞前先在Hnak"s液中加青、鏈霉素，使其含量為青霉素100IU/mL，鏈霉素100μg/mL，用7％NaHC03調整pH至7．2～7．4，將胰蛋白酶調整pH7．6(玫瑰紅色)。置3
2、7℃水浴鍋中預熱備用。2.取胚及剪碎將胚蛋氣室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒氣室，以鑷子擊破卵殼并棄之，撕破卵膜揭之，繼撕破絨尿膜、羊膜，取出胚胎于滅菌平皿中。剪去頭部、翅爪及內臟，用Hank"s液(簡稱H液)洗去體表血液，移人滅菌三角瓶中，用滅菌剪刀剪碎雞胚，使成為約1mm3大小的碎塊，加5mLH液輕搖，靜止1～2min，使其組織塊下沉。吸去上層懸液，依同法再洗2次，至上懸液不混濁為止，吸干H液留組織。3．消化自水浴鍋內取出預熱的胰酶，按組織塊量約3～5倍加入三角瓶中，1個雞胚約需5mL胰酶，三角瓶上加塞，以免CO2揮發(fā)及污染。37℃水浴約20min左右，每隔5min輕
3、輕搖動1次，由于胰酶作用，使細胞與細胞之間的氨基和羧基游離，待液體變混而稍稠，此是再輕搖可見組織塊懸浮在液體內而不易下沉時，則需中止消化，如再繼續(xù)消化下去可破壞細胞膜而不易貼壁生長，如果消化不夠，則細胞不易分散。4．洗滌取出三角瓶后靜置1min，讓組織塊下沉后，吸去胰酶液，用10mLHank"s液反復輕洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留組織塊。5．吹打加2mL含血清的0．5％水解乳蛋白營養(yǎng)液或：MEM培養(yǎng)液，以粗口吸管反復吹吸數(shù)次，使細胞分散，此時可見營養(yǎng)液混濁即為細胞懸液。靜置1min，使未沖散的組織塊下沉后，小心地將細胞懸液吸出1mL于20mL營養(yǎng)液中，此液細胞數(shù)約5
4、0萬～70萬/mL。如需大量細胞，可繼續(xù)加營養(yǎng)液沖打，一個雞胚約可做100mL細胞懸液。6．細胞計數(shù)取上述細胞懸液0．5mL加入0．1％結晶紫一檸檬酸(0.1mol/L)溶液2mL，置室溫或37℃溫箱中5～10min，充分振動混合后，用毛細管吸取滴人血細胞計數(shù)板內，在顯微鏡下計數(shù)。計數(shù)方法按白細胞計數(shù)法，計算四角大格內完整細胞的總數(shù)。如3～5個聚集在一起，則按1個計算，然后將細胞總數(shù)按下法換算成每毫升中的細胞數(shù)。細胞數(shù)/mL=4大格細胞總數(shù)/4×10000×稀釋倍數(shù)例如：4大格的細胞總數(shù)為284個，而稀釋倍數(shù)為5(0．5mL染色液)，則每毫升細胞懸液的細胞數(shù)為284/4×
5、10000×5=3．5×104個。7．稀釋按照每毫升50萬～70萬個細胞密度的標準，將細胞懸液用營養(yǎng)液稀釋之。(計數(shù)時，可見到大部分細胞完整分散，3～5個細胞成堆，且細胞碎片很少，說明消化適度；如分散細胞少，則消化不夠；如細胞碎片多，則消化過度。)活細胞計數(shù)法取2％臺盼藍溶液1滴，細胞懸液1滴，混合計數(shù)，活細胞不著色，死細胞呈藍色。8．分裝培養(yǎng)分裝于鏈霉素瓶中，每瓶約1mL，瓶口橡皮塞要塞緊。不合適者棄去，以免漏氣造成污染或C02跑掉而營養(yǎng)液變堿。將細胞瓶橫臥于培養(yǎng)盤中，于瓶上面劃一直線，以表示直線的對側面為細胞在瓶內的生長位置。瓶上注明組別、日期，置37℃溫箱培養(yǎng)，4h
6、后細胞即可貼附于瓶壁，24～36h生長成單層細胞，此時可吸去培養(yǎng)液，更換維持液，并接種病毒。附：細胞培養(yǎng)所需的常用培養(yǎng)基與試劑1．Hank’s液配制原液甲NaCl8gKCl2gMgSO4·7H202gMgCl2·6H202g2．8％CaCl2100mL雙蒸水加至1000mL先將固體成分加于800mL雙蒸水中，加溫到50～60℃加速溶解，再加入CaCl2溶液，最后加雙蒸水補足到1000mL。加氯仿2mL，搖勻后于4℃貯存。原液乙Na2HPO4·2H201.2gKH2PO4·2H201.2g葡萄糖20g0．4％酚紅lOOmL雙蒸水加：1000mL將上列各物混合后使其溶解，加氯
7、仿2mL，搖勻后于4℃貯存。Hank"s工作液原液甲1份原液乙1份雙蒸水18份工作液分裝100mL，或500mL鹽水瓶中，115~C滅菌10min，使用前以7％NaHCO3調節(jié)pH至07．2～7．6。2．0．4％酚紅溶液配制酚紅0.4g0．1％NaOH溶液11.28mL將酚紅置于研缽中，加磨邊緩緩加NaOH溶液，直到所有顆粒完全溶解，置于至lOOmL量杯中，最后加雙蒸水至lOOmL，搖勻后，保存于4℃冰箱內備用。3.0.5％乳蛋白水解物溶液配制乳蛋白水解物5gHank"s液l000mL將乳蛋白水解物放入1000mLHank"s
