原代細(xì)胞培養(yǎng)方法.doc

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1、ScienCell原代細(xì)胞培養(yǎng)方法2018.06.07原代細(xì)胞在復(fù)蘇和傳代前一定要包被培養(yǎng)瓶，以促進(jìn)細(xì)胞貼壁。以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（sciencell，貨號(hào)#8000）為例：1.培養(yǎng)瓶包被包被液纖維粘連蛋白（sciencell，貨號(hào)#8248）以1-2ug/cm2的濃度包被培養(yǎng)瓶?？蓪?mg/ml的纖維粘連蛋白不含鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液（sciencell，貨號(hào)#0303）稀釋100倍，T-75培養(yǎng)瓶中加入10ml左右，37度孵箱1小時(shí)或4度冰箱過(guò)夜，并用滅菌雙蒸水洗滌培養(yǎng)瓶2遍（此步驟非常重要，必須

2、清洗2遍），包被好的培養(yǎng)瓶不要放置超過(guò)24小時(shí)。2.配制培養(yǎng)基以ECM培養(yǎng)基為例把胎牛血清（sciencell，貨號(hào)#0025）、生長(zhǎng)因子（sciencell，貨號(hào)#1052）和雙抗（sciencell，貨號(hào)#0503）加入培養(yǎng)液中，混勻后的完全培養(yǎng)基于4度保存，應(yīng)盡快使用?？煞盅b以延長(zhǎng)效期。3.細(xì)胞復(fù)蘇在培養(yǎng)瓶中加入配制好的ECM培養(yǎng)基10ml（推薦復(fù)蘇至T75培養(yǎng)瓶，如T25瓶子加5ml）從液氮中取出凍存原代細(xì)胞，37度水浴凍融，凍融過(guò)程中可以輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)胞，加快凍融速度（注意原代細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)一定不

3、要離心），將融化的細(xì)胞放入已加入培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，再用1ml培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞凍存管，保證原代細(xì)胞都被加入培養(yǎng)瓶中，然后靜置于孵箱，12-16小時(shí)后更換培養(yǎng)基以除去DMSO。1.原代細(xì)胞傳代細(xì)胞生長(zhǎng)至70-80%左右可以傳代，傳代比例1:2或1:3為佳。首先棄去培養(yǎng)基，PBS或D-Hank’s液洗滌培養(yǎng)瓶2遍，加入適量0.25%Trypsin-EDTA，37度孵育，輕拍培養(yǎng)瓶側(cè)面，顯微鏡下觀察原代細(xì)胞消化情況。細(xì)胞消化好后，加入適量的胰酶中和液以中和胰酶，然后將原代細(xì)胞和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r

4、pm離心5分鐘。然后棄去上清液，以1-2ml培養(yǎng)基重新懸浮原代細(xì)胞，加入包被好的已加入培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。根據(jù)原代細(xì)胞生長(zhǎng)情況，大概每2天更換培養(yǎng)基。如果您在原代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中有任何問(wèn)題，歡迎一起交流探討。以上資料由北京裕恒豐科技有限公司提供