《原代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)》PPT課件

《《原代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)》PPT課件》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。

1、原代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)費(fèi)曉芳掌握無(wú)菌操作技術(shù)。了解小鼠解剖操作技術(shù)。了解原代細(xì)胞培養(yǎng)的一般方法與步驟。了解培養(yǎng)細(xì)胞的消化分散。了解細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。了解倒置顯微鏡的使用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅簩?shí)驗(yàn)原理：原代細(xì)胞培養(yǎng)是將機(jī)體內(nèi)的某組織取出，分散成單細(xì)胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長(zhǎng)、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細(xì)胞的分裂繁殖、細(xì)胞的接觸抑制、以及細(xì)胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：動(dòng)物的選擇：選擇大約一半足孕時(shí)間的胚胎，10－13天齡胚胎含有最大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞可從這些細(xì)胞衍生獲得。每組小鼠胚

2、胎2-5個(gè)實(shí)驗(yàn)材料：每組的超凈臺(tái)中有以下物品：1.50ml配制好的RPMI1640培養(yǎng)液1瓶；8ml小牛血清（FCS)1瓶；100ml0.25%胰蛋白酶1瓶；PBS(-)1瓶2.100ml滅菌燒杯2個(gè)；3、50ml離心筒2個(gè)4、滅菌培養(yǎng)皿1個(gè)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶1個(gè)4、1ml，200μl移液器各1支；槍頭盒2個(gè)；無(wú)菌玻璃攪拌棒1個(gè)5、細(xì)胞計(jì)數(shù)板1塊；6、滅好菌的鑷子1把，剪刀1把；7、酒精燈1臺(tái)；試驗(yàn)操作步驟：1)胚胎的分離。適用哺乳動(dòng)物(倉(cāng)鼠、小鼠和大鼠)a．采用認(rèn)可的方案處死嚙齒動(dòng)物。b．立即在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)用

3、70％乙醇擦洗整個(gè)動(dòng)物。c．用無(wú)菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無(wú)菌鑷子將皮膚扯向后腿。d．用另一無(wú)菌的剪刀和鑷子切開(kāi)腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿上。e．剔除胚胎周?chē)陌?，將胚胎放于無(wú)菌的含有無(wú)菌PBS的100ml燒杯中。f．漂洗胚胎，去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。仔細(xì)清洗小鼠腹部2)將1－2個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移至一個(gè)小的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用新的無(wú)菌剪刀小心地絞碎胚胎，用PBS漂洗。3)在無(wú)菌狀態(tài)下，將絞碎的胚胎轉(zhuǎn)移于一50ml的無(wú)菌離心筒中,加入40ml0.25％的無(wú)菌

4、胰蛋白酶,用攪拌棒輕輕攪動(dòng)。4)在溫暖的環(huán)境中或置于37°C培養(yǎng)箱中輕輕搖動(dòng)15分鐘。5)讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含有懸浮細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)移至一無(wú)菌50ml的離心管中，該管內(nèi)按照每10ml上清加入lml小牛血清的比例加入牛血清以滅活,胰蛋白酶。6)加人新鮮胰蛋白酶溶液(見(jiàn)前述步驟)于含有殘留未消化組織塊的原來(lái)的50ml離心筒中，重復(fù)步驟4和5。7)離心混合的細(xì)胞懸液，1200r／rain，5分鐘，棄上清。8)用新鮮的無(wú)菌PBS重懸沉淀的細(xì)胞，按步驟7再次離心。9)用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞直至上清清亮

5、為止。10)用含有10％牛血清和抗生素(如青霉素、鏈霉素)的DMEM(GIBCO／BRL)lOml再懸沉淀，并使終體積為20ml。11)讓殘留的大塊未破碎的組織或特殊顆粒物質(zhì)沉降?？刹捎脭?shù)層無(wú)菌紗布過(guò)濾細(xì)胞懸液以去除任何殘留的細(xì)胞塊。12)為確定現(xiàn)有細(xì)胞濃度，加入0.2ml細(xì)胞懸液于1.8ml1％醋酸溶液中以裂解紅細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。（細(xì)胞記數(shù)方法見(jiàn)傳代培養(yǎng)課件）13)按每細(xì)胞瓶Ix106細(xì)胞的數(shù)量接種于10ml組織培養(yǎng)液中，在飽和濕度的37℃C02培養(yǎng)箱中孵育直至細(xì)胞鋪滿。14）24小時(shí)后

6、即可觀察。細(xì)胞記數(shù)1.按上述方法，用胰蛋白酶處理細(xì)胞，細(xì)胞重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中。2.用沾有70%酒精的棉球擦凈細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片，蓋玻片放好在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上。3.用移液器吸取細(xì)胞標(biāo)本10μl，加入10μl臺(tái)盼氏蘭溶液混勻，吸取10μl混合液從蓋玻片的一側(cè)將混合液打入蓋玻片與計(jì)數(shù)板之間。4.在顯微鏡下，計(jì)數(shù)或細(xì)胞。5.計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)板每一小室中，上下左右角和中間的大方格中（5個(gè)格）的細(xì)胞數(shù)。6.在取一細(xì)胞樣品，同上在細(xì)胞板的另一小室計(jì)細(xì)胞數(shù)。7.合計(jì)10個(gè)大方格中的細(xì)胞。算出1?10-3ml的細(xì)胞數(shù)。（每個(gè)大方格

7、1?10-4ml?10個(gè)大方格?10-3ml溶劑）細(xì)胞總數(shù)乘以1000即得每毫升計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)。8.計(jì)數(shù)完畢，用雙蒸水清洗細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片。用擦凈紙擦干。每毫升細(xì)胞總數(shù)=[(A1+B1+C1+D1+E1)+(A2+B2+C2+D2+E2)]觀察培養(yǎng)情況預(yù)祝你馬到成功！