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1、經(jīng)驗(yàn)分享——原代細(xì)胞和干細(xì)胞培養(yǎng)中可能出現(xiàn)的問(wèn)題CytokinesAntibodiesELISAsCellAssaysTransfectionReagentsHumanCellsOptimizedMediaClassicalMediaSeraCellCultureReagentsCellCultureCellBiologyTrainingCoursesThreePromoCellBrandsCellCultureMolecularBiologyQualityManagement1990年開始科學(xué)家指導(dǎo)科學(xué)家用“技術(shù)”取代“經(jīng)驗(yàn)”用
2、“經(jīng)驗(yàn)”取代“運(yùn)氣”細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生問(wèn)題的可能原因微生物污染(I)細(xì)菌污染培養(yǎng)基渾濁培養(yǎng)基變黃（pH值改變）顯微鏡下：移動(dòng)的黑點(diǎn)或桿狀物大小：1-5μm來(lái)源：操作人員/水浴不能再進(jìn)一步培養(yǎng)?丟棄!真菌污染培養(yǎng)基變黃（pH值改變）生長(zhǎng)相對(duì)緩慢來(lái)源：氣流顯微鏡下：菌絲體—主要是植物式的生長(zhǎng)模式分枝菌絲—菌絲體，孢子生產(chǎn)能力強(qiáng)不要打開培養(yǎng)容器，?直接丟棄！微生物污染(II)酵母菌污染培養(yǎng)基呈云霧狀橢圓形，酵母細(xì)胞芽接，成鏈大約3-5μm來(lái)源：氣流可以用抗真菌藥劑清除（如兩性霉素B和制霉菌素）微生物污染(III)支原體污染首次發(fā)現(xiàn)于1898
3、年，被定義為病毒是已知的能自我復(fù)制的最小原核生物直徑為0.2-0.8μm?能夠通過(guò)孔徑為0.45μm的纖維素和聚乙烯醇過(guò)濾器（由于其變形的能力，甚至能夠穿過(guò)0.22μm寬的孔徑?。┤狈?xì)胞壁肽聚糖?耐青霉素一般在培養(yǎng)中無(wú)明顯的表象（肉眼不可見，顯微鏡下也不可見一般發(fā)生在胞外，只有極少數(shù)幾率發(fā)生在胞內(nèi)微生物污染(IV)微生物污染(IV)HK-2細(xì)胞(人腎近曲小管上皮細(xì)胞)復(fù)蘇后細(xì)胞第一天貼壁，但細(xì)胞中可見空泡樣改變?nèi)缓髠鞔蟪霈F(xiàn)明顯生長(zhǎng)遲緩空泡增加，繼而細(xì)胞崩解培養(yǎng)基是DMEM/F12：10%FBS凍存液是90%FBS+10%DMS
4、O支原體污染后的表現(xiàn)和肉眼可見特征即使細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中支原體的濃度達(dá)到非常高的水平（大于108個(gè)支原體/ml），仍然沒有任何明顯可見的污染征兆培養(yǎng)基的顏色提前變化（pH值轉(zhuǎn)變）倍增時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞形態(tài)改變細(xì)胞表層穿孔細(xì)胞周邊不均勻空泡形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解對(duì)生長(zhǎng)速度的不利影響支原體能夠與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并分泌有害的代謝產(chǎn)物，從而對(duì)細(xì)胞增殖能有50%的抑制作用（有這篇文獻(xiàn)為證McGarrityetal.,1984）葡萄糖快速降低，形成酸?pH值轉(zhuǎn)變精氨酸耗盡?抑制蛋白質(zhì)的生物合成，細(xì)胞分裂和細(xì)胞生長(zhǎng)引起染色體畸變和多種易位（McGarrity
5、etal.,1978）基因芯片和基因表達(dá)譜產(chǎn)生顯著的變化支原體能夠占總蛋白的50%和純化總DNA的15-30%他們甚至能夠基本上控制宿主細(xì)胞所有的代謝功能在細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)支原體污染以后的后果對(duì)生長(zhǎng)速度的不利影響支原體能夠與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并分泌有害的代謝產(chǎn)物，從而對(duì)細(xì)胞增殖能有50%的抑制作用（有這篇文獻(xiàn)為證McGarrityetal.,1984）葡萄糖快速降低，形成酸?pH值轉(zhuǎn)變精氨酸耗盡?抑制蛋白質(zhì)的生物合成，細(xì)胞分裂和細(xì)胞生長(zhǎng)引起染色體畸變和多種易位（McGarrityetal.,1978）基因芯片和基因表達(dá)譜產(chǎn)生顯著的變
6、化支原體能夠占總蛋白的50%和純化總DNA的15-30%他們甚至能夠基本上控制宿主細(xì)胞所有的代謝功能因此要進(jìn)行支原體檢測(cè)以便驗(yàn)證支原體的存在在細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)支原體污染以后的后果支原體的檢測(cè)DNA熒光染色（Bisbenzimid,DAPI）（圖例）PCR技術(shù)（圖例）一般以下情況需要進(jìn)行支原體檢測(cè)：新型的細(xì)胞和病毒培養(yǎng)物持續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系每月進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)實(shí)驗(yàn)室污染的情況下每周進(jìn)行檢測(cè)在每次液氮再次凍存之前對(duì)細(xì)胞特征進(jìn)行改造修飾之后在無(wú)法得到重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的情況下實(shí)驗(yàn)員察覺到了顯著的支原體污染時(shí)！支原體的檢測(cè)DNA熒光染色（Bisbenz
7、imid,DAPI）（圖例）PCR技術(shù)（圖例）（特異的引物設(shè)計(jì)來(lái)自高度保守的核糖體RNAs/16S-rRNA的DNA編碼序列。在支原體中，保守的rRNA基因序列非常類似。這些引物不會(huì)檢測(cè)到細(xì)菌或者動(dòng)物的DNA序列）一般以下情況需要進(jìn)行支原體檢測(cè)：新型的細(xì)胞和病毒培養(yǎng)物持續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系每月進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)實(shí)驗(yàn)室污染的情況下每周進(jìn)行檢測(cè)在每次液氮再次凍存之前對(duì)細(xì)胞特征進(jìn)行改造修飾之后在無(wú)法得到重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的情況下實(shí)驗(yàn)員察覺到了顯著的支原體污染時(shí)！被污染的細(xì)胞培養(yǎng)物或者病毒儲(chǔ)液的處理立即隔離培養(yǎng)物（培養(yǎng)箱），并檢測(cè)相應(yīng)的凍存細(xì)胞樣品通知所
8、有相關(guān)人員對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)消毒對(duì)無(wú)法替代的，珍貴的細(xì)胞立即實(shí)施搶救高壓滅菌/丟棄那些可以替代的細(xì)胞支原體清除的方法抗生素氟喹諾酮類衍生物環(huán)丙沙星(例如PromoKine的產(chǎn)品BIOMYC-3)支原體去除試劑（MRA）四環(huán)素類BIOMYC-1和2(P
