原代細胞培養(yǎng)實驗2.ppt

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1、原代細胞培養(yǎng)實驗費曉芳掌握無菌操作技術(shù)。了解小鼠解剖操作技術(shù)。了解原代細胞培養(yǎng)的一般方法與步驟。了解培養(yǎng)細胞的消化分散。了解細胞計數(shù)方法。了解倒置顯微鏡的使用。實驗?zāi)康暮鸵螅簩嶒炘恚涸毎囵B(yǎng)是將機體內(nèi)的某組織取出，分散成單細胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細胞的分裂繁殖、細胞的接觸抑制、以及細胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。實驗內(nèi)容：動物的選擇：選擇大約一半足孕時間的胚胎，10－13天齡胚胎含有最大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細胞，成纖維細胞可從這些細胞衍生獲得。每組小鼠胚胎2-5個實驗材料：每組的超凈臺中有以下物品：1.50ml配制好的

2、RPMI1640培養(yǎng)液1瓶；8ml小牛血清（FCS)1瓶；100ml0.25%胰蛋白酶1瓶；PBS(-)1瓶2.100ml滅菌燒杯2個；3、50ml離心筒2個4、滅菌培養(yǎng)皿1個，細胞培養(yǎng)瓶1個4、1ml，200μl移液器各1支；槍頭盒2個；無菌玻璃攪拌棒1個5、細胞計數(shù)板1塊；6、滅好菌的鑷子1把，剪刀1把；7、酒精燈1臺；試驗操作步驟：1)胚胎的分離。適用哺乳動物(倉鼠、小鼠和大鼠)a．采用認可的方案處死嚙齒動物。b．立即在無菌超凈臺內(nèi)用70％乙醇擦洗整個動物。c．用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。d．用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部

3、，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養(yǎng)皿上。e．剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的100ml燒杯中。f．漂洗胚胎，去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。仔細清洗小鼠腹部2)將1－2個胚胎轉(zhuǎn)移至一個小的無菌培養(yǎng)皿中，用新的無菌剪刀小心地絞碎胚胎，用PBS漂洗。3)在無菌狀態(tài)下，將絞碎的胚胎轉(zhuǎn)移于一50ml的無菌離心筒中,加入40ml0.25％的無菌胰蛋白酶,用攪拌棒輕輕攪動。4)在溫暖的環(huán)境中或置于37°C培養(yǎng)箱中輕輕搖動15分鐘。5)讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含有懸浮細胞的液體轉(zhuǎn)移至一無菌50ml的離心管中，該管內(nèi)按照每10ml

4、上清加入lml小牛血清的比例加入牛血清以滅活,胰蛋白酶。6)加人新鮮胰蛋白酶溶液(見前述步驟)于含有殘留未消化組織塊的原來的50ml離心筒中，重復(fù)步驟4和5。7)離心混合的細胞懸液，1200r／rain，5分鐘，棄上清。8)用新鮮的無菌PBS重懸沉淀的細胞，按步驟7再次離心。9)用PBS反復(fù)洗滌細胞直至上清清亮為止。10)用含有10％牛血清和抗生素(如青霉素、鏈霉素)的DMEM(GIBCO／BRL)lOml再懸沉淀，并使終體積為20ml。11)讓殘留的大塊未破碎的組織或特殊顆粒物質(zhì)沉降。可采用數(shù)層無菌紗布過濾細胞懸液以去除任何殘留的細胞塊。12)為確定現(xiàn)有細胞濃度，加入

5、0.2ml細胞懸液于1.8ml1％醋酸溶液中以裂解紅細胞，用血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)。（細胞記數(shù)方法見傳代培養(yǎng)課件）13)按每細胞瓶Ix106細胞的數(shù)量接種于10ml組織培養(yǎng)液中，在飽和濕度的37℃C02培養(yǎng)箱中孵育直至細胞鋪滿。14）24小時后即可觀察。細胞記數(shù)1.按上述方法，用胰蛋白酶處理細胞，細胞重懸于細胞培養(yǎng)液中。2.用沾有70%酒精的棉球擦凈細胞計數(shù)板和蓋玻片，蓋玻片放好在細胞計數(shù)板上。3.用移液器吸取細胞標(biāo)本10μl，加入10μl臺盼氏蘭溶液混勻，吸取10μl混合液從蓋玻片的一側(cè)將混合液打入蓋玻片與計數(shù)板之間。4.在顯微鏡下，計數(shù)或細胞。5.計數(shù)細胞計數(shù)板每

6、一小室中，上下左右角和中間的大方格中（5個格）的細胞數(shù)。6.在取一細胞樣品，同上在細胞板的另一小室計細胞數(shù)。7.合計10個大方格中的細胞。算出1?10-3ml的細胞數(shù)。（每個大方格1?10-4ml?10個大方格?10-3ml溶劑）細胞總數(shù)乘以1000即得每毫升計數(shù)細胞懸液的細胞數(shù)。8.計數(shù)完畢，用雙蒸水清洗細胞計數(shù)板和蓋玻片。用擦凈紙擦干。每毫升細胞總數(shù)=[(A1+B1+C1+D1+E1)+(A2+B2+C2+D2+E2)]觀察培養(yǎng)情況預(yù)祝你馬到成功！