原代細胞培養(yǎng) 實驗報告.doc

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1、細胞生物學(xué)實驗報告原代細胞培養(yǎng)1.實驗?zāi)康模毫私庠泶毎囵B(yǎng)的基本方法，初步掌握無菌操作的方法。2.實驗用品：（1）儀器及器材：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、手術(shù)剪、解剖盤、膠頭滴管、微量移液管、培養(yǎng)皿、離心機、注射器、L型針頭（2）實驗藥品：蒸餾水、75%酒精溶液、PBS溶液、細胞培養(yǎng)液（3）實驗材料：小鼠3.實驗原理：（1）動物細胞培養(yǎng)：從動物體內(nèi)取出體細胞，在體外模擬體內(nèi)環(huán)境在無菌、適宜溫度和一定的營養(yǎng)條件下，使之生存、生長、繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。原代細胞培養(yǎng)：直接從體內(nèi)獲取細胞組織或器官進行體外培養(yǎng)至第一次傳代培養(yǎng)為止。細胞培養(yǎng)至一定程度后，需再做培養(yǎng)。及培養(yǎng)的細胞分散后，

2、從一個容器以一定比例轉(zhuǎn)移到另一容器擴大培養(yǎng)。代數(shù)：傳代培養(yǎng)累計次數(shù)（2）細胞培養(yǎng)的條件①氣體條件：有一定的O）（小于空氣中濃度）和CO2（5%）②無菌環(huán)境：培養(yǎng)用品應(yīng)高溫滅菌，培養(yǎng)液應(yīng)無菌處理，操作應(yīng)在超凈工作臺無菌操作。③最適溫度：36～37℃為最適溫度，30～37℃細胞可進行代謝，4℃細胞可存活數(shù)天。④滲透壓：一般為260～320mmol/l（人血漿一般為290mmol/l）⑤營養(yǎng)條件：含細胞生長必須的有機物，氨基酸、維生素、無機鹽、輔助物等。培養(yǎng)基中不含生長因子，因此，必須在培養(yǎng)基中加入小牛血清。⑥最適pH：7.0～7.4（中和細胞代謝廢物與酸性氣體環(huán)境）（3）貼壁生長與不貼壁生長①貼壁

3、生長：來自于實體組織的細胞多貼壁生長。貼壁生長的細胞進行傳代培養(yǎng)更換培養(yǎng)皿時有以下步驟：首先，應(yīng)輕晃培養(yǎng)皿并棄去上清液（去除死細胞），再用胰蛋白酶處理（細胞成片收縮，變圓），傾斜培養(yǎng)皿，用滴管吸去多余酶液，然后用滴管吸取PBS溶液吹打細胞并離心，最后，加入新的培養(yǎng)液，按比例分入培養(yǎng)皿中。②不貼壁生長：造血細胞、癌細胞等。半量換液法：吸取1/2培養(yǎng)液到新的培養(yǎng)皿中，再離心，取下層細胞，分入多個培養(yǎng)皿中。4.實驗步驟：（1）用斷頭法處死小鼠，置于解剖盤中。浸入75%的酒精溶液消毒3mins。取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺的解剖盤中。無菌操作打開腹腔，取出脾臟，去除周圍的脂肪組織鑷起脾臟用PBS液自上而下沖洗1

4、~2次。轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿中待用。（1）分離脾細胞，用滴管向上述無菌培養(yǎng)皿中滴入PBS液30滴。用L型針頭注射器在皿中吸取PBS液0.2ml,延脾長軸方向注射入脾內(nèi)（是脾臟膨脹以利于細胞散開）。用針尖在脾臟上扎孔。用L型針頭輕輕刮出脾細胞，棄脾臟用滴管吹散刮出的細胞。（2）吸取上述分離的單個脾細胞懸液放入Eppendorf管中,使其為量1ml,以1000r/min離心5mins。（3）去塑料培養(yǎng)皿一個，用微量移液管（1ml）加入細胞培養(yǎng)液2ml。在蓋上加標記待用。（4）用微量移液管（200μl）吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400μl，加入步驟（3）離心后并棄去上清液的Eppendorf管中，用槍頭吹散并混

5、勻細胞然后吸取200μl接種于上述塑料培養(yǎng)皿中混勻，放入-37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.實驗結(jié)果：細胞少部分正常生長，大部分死亡。3.分析與討論（1）結(jié)果分析：脾細胞是高度分化的體細胞，功能上屬于淋巴B細胞。成熟脾細胞在體內(nèi)不進行分裂，同時由于其屬于淋巴細胞，因而其壽命較短。因此，在此次體外培養(yǎng)實驗，對其進行傳代培養(yǎng)的意義不大，而其死亡率較高也比較正常。當然，操作不當也是細胞死亡率較大的一個主要原因，以后應(yīng)養(yǎng)成良好的實驗習(xí)慣。（2）注意事項①取脾臟細胞：脾細胞是紅色的。取脾臟細胞時，應(yīng)把脾刮至PBS溶液呈紅色，同時，保證脾不掉碎屑。這樣得到的細胞是比較大量同時也比較純凈的。②無菌操作：無

6、菌操作時，動作應(yīng)迅速，否則會使培養(yǎng)皿中進入細菌，影響實驗結(jié)果③無菌操作：在無菌操作臺上操作時，應(yīng)注意不可使袖口碰到工作臺上的物品，以免污染④污染的預(yù)防：預(yù)防是防止細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的最好辦法。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。一般預(yù)防可從以下幾方面著手：從物品、用品消毒滅菌著手：細胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。從操作者做起：（1）操作者責任心要強，要細心穩(wěn)重，操作技術(shù)要熟練。進無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘，按規(guī)定穿隔離衣。進入后關(guān)好門，坐下來盡量少走動。工

7、作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi)，更不能隨便使，以免造成大批污染?！。?）操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。?。?）操作時要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實驗完畢及時收拾，保持實驗室清