崔福愛實(shí)驗(yàn)二葡聚糖凝膠分離藍(lán)葡聚糖和溴酚藍(lán)

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1、實(shí)驗(yàn)二葡聚糖凝膠分離藍(lán)葡聚糖和溴酚藍(lán)崔福愛生化與分子生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．掌握生化分離技術(shù)——層析技術(shù)的基本原理。2．掌握葡聚糖凝膠的特性及凝膠層析的原理。3．學(xué)習(xí)葡聚糖凝膠層析的基本操作技術(shù)（凝膠處理、裝柱、平衡、上樣、洗脫、收集、檢測）。層析法也稱色譜法，是一種廣泛運(yùn)用的物質(zhì)分離純化、分析鑒定技術(shù)。1903年俄國植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。將植物色素溶液通過裝有CaCO3吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開。用色彩（chroma）和圖譜（graphs）組成色譜一詞（Chromatography)

2、層析法依據(jù)：混合物中各組分的理化性質(zhì)差異——吸附力、分子形狀、大小、酸堿性或分子極性、分子親和力以及分配系數(shù)最終達(dá)到對物質(zhì)進(jìn)行分離純化和分析鑒定的目的?；驹恚汗潭ㄏ嗪土鲃酉喙潭ㄏ唷潭ú粍恿鲃酉唷獙潭ㄏ嘧鲉蜗蛳鄬\(yùn)動，推動樣品中各組分通過固定相向前移動。各組分理化性質(zhì)不同，對流動相和固定相具有不同的作用力，因此在流動相推動樣品通過固定相的過程中，通過不斷地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各組分在固定相中的遷移距離不等，達(dá)到分離。分類：①流動相的物理狀態(tài)：氣相和液相②方式：紙、薄層、柱③原理：吸附、分配、凝膠、離子交換、親和、金屬螯合、疏水、反相凝

3、膠層析(GelChromatography)(凝膠過濾、凝膠色譜、分子篩層析、分子排阻層析)①定義：指混合物隨流動相流經(jīng)固定相的層析柱時(shí)，混合物中各組分按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。②基本原理：固定相：凝膠，惰性三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故稱分子篩，包括瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺、瓊脂糖-葡聚糖復(fù)合凝膠。流動相：洗脫液交聯(lián)葡聚糖凝膠多聚葡萄糖與環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)球狀顆粒，商品名為SephadexG系列G—交聯(lián)度：G后面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示不同的規(guī)格型號，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150和G-200八種，具體含義為吸水

4、量（g）/10g干膠。交聯(lián)度與孔徑大小成反比：交聯(lián)度越大（G?。讖皆叫?，吸水性小；交聯(lián)度越?。℅大），，孔徑越大，吸水性大。因此，“G”反映凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。凝膠層析的基本原理樣品加于柱上，樣品隨洗脫液的流動而向下移動，同時(shí)作垂直向下運(yùn)動和不定向擴(kuò)散運(yùn)動→小分子可進(jìn)入凝膠空內(nèi)部，流程長，速度慢，后流出；大分子不能進(jìn)入凝膠空內(nèi)部，顆粒間移動，流程短，先流出→大小分子彼此分開。數(shù)學(xué)模型VoViVtVi—凝膠孔內(nèi)水（內(nèi)水）Vo—顆粒間水（外水）Vg—凝膠體積總體積Vt=Vi+Vo+VgKd—分配系數(shù)：精確衡量混合物中某一待分離成分在凝膠柱內(nèi)的洗脫行

5、為，反映物質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒的程度，是溶質(zhì)分子大小的一個(gè)函數(shù)Ve—洗脫體積：分離物被洗脫時(shí)所用的洗脫液體積Ve=Vo+Kd·Vi洗脫曲線：以洗脫體積為橫坐標(biāo)，各物質(zhì)濃度/吸光度為縱坐標(biāo)作圖（1）完全被排阻的極端大分子，Ve=Vo，Kd=0（2）中等分子，Ve=Vo+Kd·Vi，01③影響因素層析柱的選擇及裝填：柱大小—分離樣品量凝膠型號—分辨率：各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。凝膠分離范圍之外的分子，難以分離。如大小不同的兩種全排阻分

6、子/完全滲透分子。洗脫液：溶解待分離物質(zhì)，不變性加樣量：1%～5%凝膠的再生實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)以葡聚糖凝膠G-25作為固定相載體，來分離藍(lán)色葡聚糖-2000和溴酚藍(lán)。藍(lán)色葡聚糖-2000分子量接近2×106，而溴酚藍(lán)分子量為669，二者分子量相差較大。兩者混合物加到葡聚糖凝膠層析柱，利用緩沖液洗脫，在洗脫過程中，大分子的藍(lán)葡聚糖不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，而沿凝膠顆粒間隙直接先流出柱外；小分子的溴酚藍(lán)可完全進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，流速緩慢，后流出柱外，二者通過層析柱的時(shí)間不同而分開。實(shí)驗(yàn)方法1.凝膠的選擇和處理：用蒸餾水把凝膠充分膨脹，把雜質(zhì)漂洗干凈。2.裝柱：⑴將層析柱垂直夾于鐵架上

7、，先加入蒸餾水10ml，打開柱下端的螺旋夾，使蒸餾水下流至剩余高度約2-3cm時(shí)關(guān)閉出口，以排除底部氣泡。⑵將膨脹好的凝膠邊攪拌邊連續(xù)加入層析柱中，灌注高度為10-12cm。⑶用螺旋夾控制流速為20-40滴/分鐘，用洗脫緩沖液平衡幾分鐘后，即可使用。3.加樣：將層析柱上端的液面下降到凝膠表面，將螺旋夾擰緊。取樣品200μl沿層析柱內(nèi)壁緩緩加入到液面上，打開螺旋夾，用燒杯收集流出的液體。當(dāng)樣品液體恰好完全進(jìn)入凝膠柱內(nèi)時(shí)，用洗脫緩沖液小心沖洗柱壁上的樣品液體，并持續(xù)流洗、收集。4.收集：先用量筒收集洗脫液體（約4ml），待柱中藍(lán)葡聚糖-2000開始移出改用EP管收集液

8、體，每管收