布魯斯菌BvrR基因核酸疫苗的構(gòu)建及免疫效果研究

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1、分類號(hào)：單位代碼：10159密級(jí)：公開學(xué)號(hào)：200810049博士學(xué)位論文中文題目：布魯斯菌BvrR基因核酸疫苗的構(gòu)建及免疫效果研究英文題目：TheconstructionandimmunoreactivityofDNAvaccineencodingBvrRagainstBrucella論文作者：陳博指導(dǎo)教師：王桂珍教授學(xué)科專業(yè)：病原生物學(xué)完成時(shí)間：2018年10月中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文布魯斯菌BvrR基因核酸疫苗的構(gòu)建及免疫效果研究TheconstructionandimmunoreactivityofDNAvacc

2、ineencodingBvrRagainstBrucella論文作者陳博指導(dǎo)教師王桂珍教授申請(qǐng)學(xué)位醫(yī)學(xué)博士培養(yǎng)單位基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院一級(jí)學(xué)科基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科病原生物學(xué)研究方向細(xì)菌的核酸疫苗研究論文起止時(shí)間2009年3月—2018年10月論文完成時(shí)間2018年10月中國醫(yī)科大學(xué)（遼寧）2018年10月中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文摘要目的：布魯斯菌(Brucella)是引起布魯斯菌病(Brucellosis)的病原體。布魯斯菌病可以引起人類的波狀熱，牛、羊、豬等家畜的流產(chǎn)。布魯斯菌可分為六個(gè)種，即馬耳他布魯斯菌、流產(chǎn)布魯斯菌、豬布魯斯菌

3、、綿羊布魯斯菌、犬布魯斯菌和沙林鼠布魯斯菌。布魯斯菌病是世界范圍內(nèi)較嚴(yán)重的人畜共患傳染病之一，在我國北方地區(qū)內(nèi)蒙古、山西、吉林、黑龍江、河北、寧夏等省區(qū)流行較廣，布魯斯菌病已經(jīng)成為最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。目前，對(duì)動(dòng)物布魯斯菌病的防治，依據(jù)各地區(qū)實(shí)際狀況的不同，主要是采用疫苗免疫接種或檢疫、撲殺的方法。迄今為止已有幾種較成功的布魯斯菌減毒疫苗應(yīng)用于生產(chǎn)，國外使用的主要有牛種布魯斯菌19(B.abortusstrain19,S19)疫苗、羊種布魯斯菌Rev.1(B.melitensisRev.1)疫苗、牛種布魯斯菌45/20(B.abortuss

4、train45/20)疫苗和粗糙型牛種布魯斯菌51(RoughstrainB.abortus51,RB51)疫苗。我國主要使用的是豬種布魯斯菌S2(B.suisstrain2,S2)疫苗。雖然這些減毒疫苗在布魯斯菌病的防治上起到了積極的作用，但它們有的毒力較強(qiáng)，在推薦劑量使用時(shí)對(duì)于妊娠動(dòng)物還存在流產(chǎn)的可能，對(duì)人類來說并不安全，存在著潛在感染人類的可能性，有的免疫保護(hù)率低，不能供人類應(yīng)用。因此有必要研制和開發(fā)新型布魯斯菌疫苗。因?yàn)椴剪斔咕且环N可以在細(xì)胞內(nèi)寄生并造成感染的病原微生物，因此可以引起機(jī)體強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，在對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)寄生菌感染方面極

5、具潛力的核酸疫苗就成為了人們關(guān)注的研究熱點(diǎn)。核酸疫苗與常規(guī)疫苗相比除了在預(yù)防細(xì)胞內(nèi)寄生菌感染方面效果較好外，還具有無感染風(fēng)險(xiǎn)、可激發(fā)長期的免疫應(yīng)答、比減毒疫苗具有更高的穩(wěn)定性并且易于制備、造價(jià)低等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)在已有核酸疫苗用于預(yù)防人和動(dòng)物的多種病毒、真菌和寄生蟲感染的報(bào)道。在布魯斯菌核酸疫苗的研究報(bào)道中，除了用布魯斯菌外膜蛋白基因構(gòu)建的核酸疫苗外，還有一些用布魯斯菌胞內(nèi)蛋白基因構(gòu)建核酸疫苗的報(bào)道。據(jù)報(bào)道，布魯斯菌胞內(nèi)蛋白如：L7/L12核糖體蛋白、Cu/Zn超氧化物歧化酶等基因皆可作為布魯斯菌核酸疫苗的候選基因并取得了較好的免疫效果。這說明，布魯斯

6、菌的胞I中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文內(nèi)蛋白基因也可以作為核酸疫苗的候選基因。布魯斯菌BvrR/BvrS雙組分系統(tǒng)是調(diào)節(jié)布魯斯菌感知系統(tǒng)的蛋白，在不同種屬的布魯斯菌中具有很高的同源性。據(jù)報(bào)道，布魯斯菌BvrR/BvrS缺失突變株表現(xiàn)出侵入細(xì)胞的能力減弱，不能抵抗溶酶體的消化作用，在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力也減弱。更進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，BvrR/BvrS的缺失使布魯斯菌失掉對(duì)細(xì)胞殺菌多聚陽離子的抵抗作用，可增加布魯斯菌細(xì)胞膜表面對(duì)表面活性劑的通透性。因此，BvrR/BvrS雙組分系統(tǒng)與布魯斯菌的毒力有關(guān)。鑒于該組蛋白在細(xì)胞內(nèi)較保守不宜變異，不同種屬的布魯斯菌B

7、vrR/BvrS基因具有高度同源性，如果該調(diào)節(jié)蛋白具有特異的免疫原性則可作為布魯斯菌的核酸疫苗，使用這一種疫苗可預(yù)防多種屬布魯斯菌的感染，在布魯斯菌病的特異性預(yù)防領(lǐng)域會(huì)有重要意義。本研究擬采用布魯斯菌BvrR/BvrS雙組分系統(tǒng)中的BvrR基因作為靶基因，插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1中構(gòu)建新型核酸疫苗pcDNA-BvrR，然后轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞分析其在細(xì)胞內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)情況。隨后將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-BvrR免疫BALB/c小鼠來探討B(tài)vrR基因核酸疫苗的免疫效果。這些研究為進(jìn)一步探討布魯斯菌BvrR基因核酸疫苗的免疫機(jī)理以及保護(hù)效果提

8、供依據(jù)。利用BvrR基因在布魯斯菌種屬之間具有高度同源性的特點(diǎn)，用一種核酸疫苗將可以預(yù)防多種屬布魯斯菌的感染。研究方法：1、BvrR基因的PCR擴(kuò)增。