黑木耳栽培技

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1、綜合性（設(shè)計(jì)性）實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱：微生物純種分離與活菌計(jì)數(shù)法姓名：陳雙翠指導(dǎo)教師：毛寧專業(yè)：生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)班級：10級（2）班實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2013年5月?6月實(shí)驗(yàn)地點(diǎn):微生物實(shí)驗(yàn)室成績：一、實(shí)驗(yàn)口的1了解從土壤屮分離和純化微生物的基本原理2掌握常用的微生物分離和純化的方法（涂布平板法、平板劃線分離法、稀釋倒平板法）3學(xué)習(xí)通過平板菌落進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)的原理與方法二、實(shí)驗(yàn)原理自然條件下的微生物往往是不同種類微生物的混合體。為了研究某種微生物的特性或者要大量培養(yǎng)和使用某種微生物，必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養(yǎng)，這種獲得

2、純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。土壤是微生物生活的良好環(huán)境，其中生活的微生物數(shù)量和種類都是極其豐富的。土壤中的微生物數(shù)量與種類非常多。以土壤為樣品，應(yīng)用梯度稀釋法、涂布平板法、平板劃線分離法、稀釋倒平板法分離各種微生物，根據(jù)不同的材料，可以采用不同方法，菌落計(jì)數(shù)后，通過菌落形態(tài)觀察并挑取菌落進(jìn)行劃線分離純化,多次重復(fù)后得到單菌落。必要時(shí)再對單菌落進(jìn)一步分離純化。在用稀釋平板法分離微生物時(shí)，還可以同時(shí)測定待分離的微生物的數(shù)量。三、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫電熱干燥箱、生化培養(yǎng)箱2器材：酒精燈電爐接種環(huán)無菌

3、試管三角瓶記號(hào)筆天平火柴無菌培養(yǎng)血無菌移液管玻璃涂棒試管架無菌生理鹽水盛無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶等四、實(shí)驗(yàn)步驟與方法1采樣;取表層以下5-10cm的土樣放入滅菌的袋屮備用?；蛘叻湃?°C的冰箱暫存。2倒平板（無菌操作）：培養(yǎng)基加熱熔化，待冷卻至55-60°C,在電爐中將三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)基熔化，取滅菌的培養(yǎng)皿，每組倒12個(gè)平板。3土壤稀釋液的制備（梯度稀釋法）1）先準(zhǔn)備好一系列含有培養(yǎng)液的試管：9ml、99ml的試管若干個(gè)。2）取lml原菌液，加入99ml試管中，吹打混勻后，吸出lml加入9ml中，吹打混勻后析出lm

4、l加入9ml依次加入制成一系列稀釋菌液。具體做法如下：稱取lg土樣,無菌操作倒入99mL無菌生理鹽水中，在震蕩器中振蕩20分鐘，使微生物細(xì)胞分散，靜置20?30s,即成IO?稀釋液；再用5L移液器，吸取稀釋IO?液lmL,移入裝有9mL無菌水的試管中，振蕩，讓菌液混合均勻，即成2稀釋液；再換一支無菌吸頭，吸取103稀釋液1譏，移入裝有9譏無菌水的試管中，振蕩，即成IO。稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成IO?、103、1（/、IO：等一系列稀釋菌液。4平板涂布、（涂布平板法）涂布平板法是一種將菌體按比例制備成若干個(gè)稀釋

5、度，再分別經(jīng)涂棒涂布培養(yǎng)而進(jìn)行微生物分離純化的方法。（1）倒平板；（2）制備土壤稀釋溶液連續(xù)不，斷稀釋，得到不同稀釋度的土壤溶液;（3）涂布分別吸取三種稀釋度菌液，均勻涂于培養(yǎng)基表面；具體步驟：將培養(yǎng)基平板編號(hào)，然后用移液槍吸取103、104、10,等一系列稀釋菌液各0.JmL對號(hào)接種在不同稀釋度編號(hào)的瓊脂平板上（每個(gè)編號(hào)設(shè)兩個(gè)重復(fù)）。再用無菌涂布棒將菌液在平板上涂布均勻，每個(gè)稀釋度用一個(gè)滅菌涂布棒；更換稀釋度時(shí)需將涂布棒灼燒滅菌。5培養(yǎng)將涂布好的平板平放于桌上20?30min,使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒轉(zhuǎn)。

6、恒溫37°C培養(yǎng)，兩天后觀察.6平板劃線分離法平板劃線分離法是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細(xì)胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表點(diǎn)擊此處添加圖片說明面通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨(dú)立分布的單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后生長繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當(dāng)作待分離微生物的純種。有時(shí)這種單菌落并非都曲單個(gè)細(xì)胞繁殖而來的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線”稀釋而達(dá)到分離目的。用滅菌接種環(huán)蘸取IO?稀釋液一環(huán)于已凝固的平板上進(jìn)行劃線。劃線可按以下兩種方式進(jìn)行：一種為交叉劃線法，是在

7、平板的一邊做第一次“Z”字形劃線。轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，將接種環(huán)在火上燒過并冷卻后，通過第二次劃線部分，做第二次'字形劃線。同法進(jìn)行第三次、第四次劃線。另一種為連續(xù)劃線法，是從平板邊緣的一點(diǎn)開始.連續(xù)作緊密的波浪式劃線，直至平板屮央。轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)1111180°,再從平板另一邊（不燒接種環(huán)）同樣劃線至平板中央。7培養(yǎng)將平板倒轉(zhuǎn)，恒溫37°C培養(yǎng)兩天后觀察菌落計(jì)數(shù)1）直接計(jì)數(shù)法（肉眼計(jì)數(shù)）含菌樣品的微生物經(jīng)稀釋分離培養(yǎng)后，每一個(gè)活菌細(xì)胞可在平板上繁殖形成一個(gè)肉眼可見的菌落，故可以根據(jù)平板上菌落的數(shù)口推算出每克含菌樣晶屮所含

8、的活菌總數(shù)（菌落形成數(shù)目）每克含菌樣品中微生物的活細(xì)胞數(shù)（菌落形成數(shù)，CFU二同一稀釋度平板上菌落平均數(shù)X10X稀釋倍數(shù)）/含菌樣品克數(shù)2）血細(xì)胞計(jì)數(shù)法將稀釋的菌液樣品滴在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下計(jì)算4-5個(gè)中格的細(xì)菌數(shù)，并求出每個(gè)小格所含細(xì)菌的平均數(shù)，再以此為依據(jù)，估算總菌數(shù)。五、實(shí)驗(yàn)記錄1）直接計(jì)數(shù)法（肉眼計(jì)數(shù)）不同濃度的活菌落數(shù)H數(shù)梯1