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《Sp1（530-623）鋅指蛋白（三個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域）的表》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、Spl（530-623）鋅指蛋白（三個(gè)ZFP結(jié)構(gòu)域）的表達(dá)與純化撰寫(xiě)人：陳思明2013-04-19修訂人：準(zhǔn)備：1.質(zhì)粒:SGl-Spl（530-623）2.金屬（Ni柱）螯合樹(shù)脂（每升表達(dá)液需要3ml樹(shù)脂）3.相關(guān)緩沖液ResuspendBuffer20mMTris,pH=7.4,500mMNaCl,8MureaWashBufferResuspendBuffer+20mMimmidazole;ElutionBufferResuspendBufl^r+500mMimmidazole;表達(dá)條件:質(zhì)?？剐园惫?jié)50
2、ig/ml表達(dá)菌珠BL21(
3、DE3)誘導(dǎo)溫度、OD6oo37°C;OD60o=0.8至1IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化后采用0.8mM;誘導(dǎo)4hours純化步驟：（以1L菌液為例）（詳見(jiàn)陳思明實(shí)驗(yàn)記錄2009年11月22日，第一本實(shí)驗(yàn)記錄本）1.收菌：4000rpmx20min2.破碎菌液：超聲或壓力（30%功率8min超聲即可）【注：1L的菌液收集的菌體重懸于20ml的ResuspendBuffer,超聲后包涵體維持在ResuspendBuffer中l(wèi)h左右，以保證目的蛋白完全溶解】3.離心：16000rpmx30min;留上清，過(guò)0.45uM濾膜；【注：由于包涵體處
4、理直接過(guò)0.45uM較難通過(guò)，浪費(fèi)濾膜，可以依次用1.20.8pm,0.45
5、im的濾膜，效果較好！】4.結(jié)合樹(shù)酯（預(yù)先用ResuspendBuffer平衡）：【注：如果樹(shù)酯是剛從20%乙醇中取出，用超純出0洗3?5次，隨后平衡10min]將上清（大約20ml左右）與3ml預(yù)平衡的樹(shù)酯混合，放置4°C旋轉(zhuǎn)混合儀上，結(jié)合時(shí)間30min,隨后放掉上清；5.洗滌雜蛋白：加入20mlWashBuffer于Ni柱，并使其慢慢滴下，洗滌時(shí)間15min:【注：保證洗滌時(shí)間不要低于15min，洗滌過(guò)程要保證Ni柱始終處于Buffer條件，不要讓Ni柱處于
6、干燥狀態(tài)】6.洗脫目標(biāo)蛋白：加入15mlElutionBuffer,放置4°C旋轉(zhuǎn)混合儀上30min,收集洗脫液，并再次用10mlElutionBuffer洗脫Ni柱上殘留的目的蛋白。7.樹(shù)酯再生：（1）先用水清洗2次，除去Ni柱上的尿素；（2）用20mMMES（pH5.0）在旋轉(zhuǎn)混合儀上處理20min,隨后用水清洗3?5次；（3）如果樹(shù)酯長(zhǎng)期不用，用20%乙醇保存Ni柱：蛋白復(fù)性(參考蛋白變復(fù)性方案)1.透析外液的組成為200mMNaCl,5mM檸檬酸鈉(防止Zi?+沉淀),10yMZnCl2,5mMp-ME,20mMTris,pH7.
7、42.透析過(guò)程中尿素的濃度采用：(a)第一步：外液中含有4M尿素，4度攪拌透析12小時(shí)(一般過(guò)夜)；(b)第二步：外液中含有3M尿素，4度攪拌透析4小時(shí)，(c)第三步：外液中含有2M尿素，4度攪拌透析4小時(shí)；(d)第四步：外液中含有1M尿素，4度攪拌透析4小時(shí)(e)第五步：外液中不含尿素，4度攪拌透析12小時(shí)；(f)第六步：重復(fù)第五步透析一次。TEV酶切1.酶切實(shí)驗(yàn)中，一般用TEV/Sp1(530-623)體積比為1:10來(lái)完成酶切過(guò)程。2.1LLB培養(yǎng)基可以獲得25mlTEV蛋白酶再加上等體積甘油，混勻后，分管分裝，?80度凍存?zhèn)溆茫?
8、.酶切電泳鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1116KDa66.245352518.414.4--TEVproteasep1(530-623)Fusionprotein--Sp1(530-623)圖1:SDS-PAGE鑒定TEV酶酶切Spl(530-623)蛋口的N端His標(biāo)簽分子篩純化將Sp1(530-623)前體蛋白的酶切體系，經(jīng)過(guò)超濾杯適當(dāng)濃縮后，再用分子篩純化，其分子篩純化的色譜結(jié)果參見(jiàn)圖2。在80ml出水體積處有一明顯的紫外吸收峰，其表觀分子量與Spl(530-623)蛋白分子量基本上吻合；180nSp1(530-623)50_J~9、osqv209060300-20406080100120140Elutionvolumn/ml圖2：分子篩純化Sp1(530-623)蛋白色譜圖Apo蛋白制備a)三個(gè)鋅指Apo態(tài)制備：往Spl(530-623)蛋白樣品中加入EDTA(25mM左右)和DTT(50mM左右)，37度反應(yīng)2小時(shí)，脫鹽柱處理即可。b)單個(gè)鋅指、三個(gè)鋅指的Apo態(tài)蛋白都很穩(wěn)定，濃度可以配到mM級(jí)；蛋白保存1.對(duì)于三個(gè)鋅指Spl的保存與使用：a)把分子篩純化后Spl(530-623)蛋白通過(guò)脫鹽過(guò)程換成如下buffer(50mMHEPES,100mMNaNO3pH6
10、.8)。b)完成buffe】更換，UV定其濃度后，分管分裝，500^1/管，?80度凍存?zhèn)溆胏)每次使用時(shí)候，取出來(lái)1支在4度條件下解凍；2.穩(wěn)定性問(wèn)題a)Spl蛋白比較穩(wěn)定，?80凍存可以保
