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1、乳酸菌的分離與純化1.實驗目的2.實驗材料2.1試驗設備天平、牛角匙、電爐、pH試紙、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、試管、棉塞、培養(yǎng)基、吸管、牛皮紙、線繩、標簽、500mL錐形瓶兩個、250mL錐形瓶兩個、試管20只、500mL燒杯兩個、250mL燒杯兩個、100mL燒杯兩個、酒精燈、石棉網(wǎng)、接種針（環(huán)）。2.2實驗儀器50L的高壓蒸汽滅菌鍋、恒壓干熱滅菌箱、超鏡臺、光學顯微鏡、75%酒精棉、冰箱。2.3實驗藥品新鮮酸奶、脫脂奶粉或全脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚綠乙醇溶液、酵母膏、瓊脂、結晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、詩壇酸復紅染液。3.試驗
2、方法及操作過程3.1BCG牛乳培養(yǎng)基配方及滅菌（A）液：脫脂奶粉10克，水50ml，加入1.6%溴甲酚綠乙醇溶液1ml，80℃滅菌20min。（B）液：酵母膏1克，水50克，瓊脂2克，pH6.8，121℃滅菌2.min。按照配方正確稱取所需藥品放于燒杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，加熱溶解，用1NNaOH或1NHCl調(diào)pH，用pH試紙對照，加瓊脂溶化，加熱過程要不斷攪拌，可適當補水。瓊脂完全溶解后倒入250mL的錐形瓶中，用紗布包扎好（注意不要污染紗布）再用牛皮紙包扎，貼上標簽（必須用鉛筆寫），注明何種培養(yǎng)基。在高壓鍋中，在1kg/cm2壓力下維持
3、30min。3.2倒BCG培養(yǎng)基平板的方法將滅好菌的A液和B液趁熱充分混合，點燃酒精燈對周圍的空氣進行滅菌，并在酒精燈的附近用左手握著平板用拇指和小拇指打開一個小縫，趁熱將培養(yǎng)液倒如平板內(nèi)，倒入的量能使培養(yǎng)基剛要覆蓋平板底部，倒好后把平板平放到實驗臺，輕輕晃動是培養(yǎng)基形成一個平面，等培養(yǎng)基冷卻凝固后倒放并貼上標簽。（注意：整個實驗要在酒精燈附近做，以保證培養(yǎng)基不染菌）3.3脫脂乳試管的配制與滅菌直接選用脫脂乳液或按脫脂奶粉10克與蔗糖5克，水95克（蔗糖與水的比例在1：10的范圍內(nèi)）的比例配制，裝量以試管的1/3為宜，115℃滅菌15min。3.4乳酸菌的
4、分離純化取市場銷售的新鮮的酸奶，分別用接種針接入BCG牛培養(yǎng)基瓊脂平板上，40℃培養(yǎng)48h，如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步定為乳酸菌。選取乳酸菌典型菌落轉(zhuǎn)致脫脂乳試管中，40℃培養(yǎng)8~24h若牛乳出現(xiàn)凝固，無氣泡，顯酸性，涂片鏡檢細胞桿狀或鏈球狀，革蘭氏染色顯陽性，則可將其連續(xù)傳代3次，最終選擇出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌種待用。3.5乳酸發(fā)酵及檢查發(fā)酵：觀察BCG培養(yǎng)基中乳酸菌菌落特征，選取長勢比較好的菌落無菌操作下將乳酸菌接種于裝有脫脂乳的試管中，40～42℃靜止培養(yǎng)。檢測：為了便于測定乳酸發(fā)酵情況，取脫脂乳試管中的溶液進行
5、革蘭氏染色，顯微鏡檢查。革蘭氏陽性，無芽胞的球菌或桿菌可定為乳酸菌，記錄測定結果。3.6實驗具體過程兩周實驗具體過程5．21上午清洗儀器、下午配BCG牛乳培養(yǎng)基100ml、滅菌、倒平板下午乳酸菌、劃線分離、配脫脂乳試管100ml、滅菌、裝10支試管5．22上午配BCG牛乳培養(yǎng)基100ml、滅菌、倒平板下午等待滅菌5．23上午第一代接到脫脂乳試管、培養(yǎng)24h(21日平板仍染菌選相似菌落乳酸菌為第一代)下午做無菌水（20min滅菌121℃）、空錐形瓶滅菌裝清明酸奶劃線分離5．24上午配BCG牛乳培養(yǎng)基100ml、滅菌、倒平板（先B后A）、脫脂乳試管第二代劃線分
6、離、脫脂乳試管做革蘭氏染色下午等待滅菌5．26上午配BCG牛乳培養(yǎng)基100ml、滅菌、倒平板（先B后A）、第三代劃線分離（光明由于染菌就此終斷光明的接種）下午等待滅菌5．27上午第三代接種到脫脂乳試管中下午配制BCG牛乳培養(yǎng)基100ml、滅菌、倒平板（先B后A）、5．28上午27日平板染菌，將剩余BCG牛乳培養(yǎng)基滅菌、倒平板、用脫脂乳試管做第四代劃線分離及革蘭氏染色下午等待滅菌5．29上午配酸奶培養(yǎng)基100ml兩瓶、滅菌、冷卻至不燙手為宜將第四代接種到酸奶培養(yǎng)基、待凝固下午寫實驗報告3.8.實驗分析用提前滅好菌的燒杯取少量從市場上購買的（伊利、蒙牛）新鮮酸
7、奶，用接種環(huán)將兩種酸奶接入已經(jīng)配好的BCG培養(yǎng)平板中（注意整個過程應在無菌條件下操作），接好種后帖上標簽進行培養(yǎng)。培養(yǎng)后的平板上大多都染上了雜菌，雜多為灰白色，只要個別平板長有淡黃色的乳酸菌菌落，且長勢不好。第一代：選擇長勢較好的乳酸菌菌落，用接種針在無菌條件下將菌種接入兩只脫脂乳試管中，接好種后帖上標簽進行培養(yǎng)。結果：兩只脫脂乳試管，一支凝固較好，顏色為乳白色略顯黃，表面有淡黃色上清液，一支凝固不好。對試管中的酸奶進行了革蘭氏染色，現(xiàn)象如下：顯微鏡下：有3種菌，革蘭氏染色為紫色，有球菌、鏈球菌和少量細長的桿菌第二代：選擇凝固較好的脫脂乳試管，用接種環(huán)在無
8、菌條件下將菌種接入BCG培養(yǎng)平板中，接好種后帖上標簽進行培養(yǎng)。培養(yǎng)
