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1、乳酸菌素Lactocin-J23的分離純化制備乳酸菌素Lactocin-J23的發(fā)酵液分離純化的方法(NH4)2SO4鹽析法沉淀乳酸菌素菌體細(xì)胞吸附純化乳酸菌素陽離子交換法分離純化乳酸菌素疏水層析法分離純化乳酸菌素乳酸菌素純度的測定(NH4)2SO4鹽析法原理是根據(jù)蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度，以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當(dāng)(NH4)2SO4加入蛋白質(zhì)溶液，(NH4)2SO4對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時，(NH4)2SO4加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白
2、溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。步驟實(shí)驗(yàn)1.取乳酸菌發(fā)酵上清液，放置于磁力攪拌器上，緩慢攪拌加入預(yù)先稱量好的(NH4)2SO4固體粉末至所需飽和度，操作必須在10-15min內(nèi)完成；2.4℃放置過夜，使其充分沉淀，10000rpm離心20min棄上清，用生理鹽水溶解沉淀；3.以0.02%mol/LpH7.4PBS溶解裝入2000Da透析袋，4℃透析12h；4.取透析袋內(nèi)樣品Bradford法測定蛋白含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1.以(NH4)2SO4鹽析法沉淀菌株Lactocin-J23發(fā)酵上清液中的細(xì)菌素，鹽析曲線如圖。從圖可知，隨著(NH4)2SO4飽和度的提高，沉淀中乳酸菌細(xì)菌素和可
3、溶性蛋白質(zhì)的量逐漸增加。在(NH4)2SO4飽和度達(dá)到40%之前，沉淀中基本沒有表現(xiàn)出抗菌活性。隨著(NH4)2SO4飽和度的增加，沉淀中開始表現(xiàn)出抗菌活性，但一直增加到(NH4)2SO4飽和度達(dá)到80%時，沉淀中的抗菌活性雖然持續(xù)增加，但仍然沒有抗菌活力達(dá)到最大值的拐點(diǎn)出現(xiàn)，暗示發(fā)酵上清液中仍然有部分抗菌肽沒有完全沉淀。綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(NH4)2SO4鹽析法雖然是一種常見的蛋白質(zhì)分離操作單元，但在分離菌株Lactocin-J23產(chǎn)生的細(xì)菌素時候存在雜蛋白多，目標(biāo)產(chǎn)物得率低等缺點(diǎn)，再加上菌株LactocinJ23分泌合成目標(biāo)抗菌肽的量較少，綜合上述原因確定(NH4)2SO4鹽析法不適
4、合于抗菌肽Lactocin-J23的分離純化。實(shí)驗(yàn)步驟：1.乳酸菌發(fā)酵液在70℃水浴加熱25min后調(diào)至吸附適宜pH，同時Bradford法和瓊脂擴(kuò)散法分別測定發(fā)酵液蛋白含量和抗菌活力；2.置于磁力攪拌器上室溫攪拌30min，使細(xì)菌素充分吸附在細(xì)胞上；3.離心收集細(xì)胞，4℃于8000rpm/min離心30min，同時測定離心上清液中蛋白含量和抗菌活力；4.收集沉淀用與吸pH值相同的5mmol/L磷酸鈉緩沖液洗滌細(xì)胞1-2次；離心30min收集沉淀懸浮于100mmo1/LNaC1溶液，用5%磷酸調(diào)至最佳解吸pH；6.4℃磁力攪拌12h，4℃于10000r/min離心30min，收集上清液0.
5、22um無菌濾膜過濾,上清液即為細(xì)菌素提取物；同時測定離心沉淀中蛋白含量和抗菌活力，以便計算抗菌肽損失率。結(jié)果與分析2.1pH對菌體細(xì)胞吸附Lactocin-J23的影響菌體細(xì)胞吸附法是基于細(xì)菌素在不同的pH條件下，細(xì)菌素和產(chǎn)生菌菌體細(xì)胞之間存在不同程度的吸附和解吸附現(xiàn)象。因此在利用菌體細(xì)胞吸附法純化Lactocin-J23之前，利用瓊脂擴(kuò)散法以抑菌圈為活性指標(biāo)，考察了不同pH范圍條件下產(chǎn)生菌Lactic和革蘭氏陽性指示菌（枯草芽孢桿菌）菌體細(xì)胞吸附Lactocin-J23的影響，結(jié)果見圖2。圖2菌株J23與指示菌對細(xì)菌素Lactocin－J23的吸附率從圖2中可知，不同pH對J23菌體和
6、指示菌細(xì)胞吸附Lactocin-J23的能力有很大的影響。對產(chǎn)生菌J23來說，在pH6.0時吸附率最大，達(dá)到80%；當(dāng)pH低于3.0或大于8.0時吸附率基本為0。對革蘭氏陽性指示菌（枯草芽孢桿菌）來說，在pH為2-9之間均能吸附上目標(biāo)細(xì)菌素，在酸性條件下其吸附能力較堿性條件下強(qiáng)，最大吸附率為55%，低于J23菌體的最高吸附率。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中確定在pH6.0時吸附Lactocin-J23,在pH2.0時從細(xì)胞表面解吸附。2.2產(chǎn)生菌J23細(xì)胞吸附純化Lactocin-J23將活化的菌株J23接種到1000mlMRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，70℃水浴加熱25min，待冷卻后根據(jù)上述研
7、究結(jié)果調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至6.0，在室溫緩慢攪拌2h，調(diào)節(jié)pH至2.0，分離純化目標(biāo)細(xì)菌素LactocinJ23，結(jié)果如表所示。從表1可知，菌株J23菌體細(xì)胞吸附-解吸附過程細(xì)菌素Lactocin-J23相對于粗發(fā)酵液純化了23.52倍，比活力由55.65AU/mg提高到1309.09AU/mg，回收率為22.5%。與(NH4)2SO4鹽析法相比，具有菌體細(xì)胞吸附法具有步驟少、操作簡易、成本低、回收率較高等優(yōu)點(diǎn)，可取代鹽析法
