乳酸菌的分離、純化與鑒定

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1、乳酸菌的分離、純化與鑒定第一部分：乳酸菌的分離、純化一、實驗器材:1.實驗藥品新鮮乳酸飲料（市售）、脫脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚綠乙醇溶液(溴甲酚綠、無水乙醇)、酵母膏、瓊脂、革蘭氏染液（結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、沙黃）、75%乙醇、香柏油、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、碳酸鈣；0.4gNaOH固體、4.2ml濃HCL(分析純)、20gCaCO3固體、酵母膏20g、瓊脂30g香柏油、脫脂奶粉100g、蔗糖10g；2.儀器與設(shè)備高壓蒸汽滅菌鍋、光學顯微鏡、培養(yǎng)箱、pH試紙、酸乳瓶、培養(yǎng)皿（φ9或φ12）、試管、300ml三角瓶（帶玻珠）、移

2、液管、天平、500ml錐形瓶、250ml錐形瓶、250ml燒杯。二、實驗步驟：1.培養(yǎng)基配制（BCG牛乳培養(yǎng)基）：　?。ˋ）溶液：取脫脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml，混合均勻后分裝入三角瓶于高壓蒸汽滅菌鍋80℃滅菌20min；（1.6%溴甲苯酚綠（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚綠加入20ml無水乙醇中，再加水至100ml制成）　?。˙）溶液：酵母膏10g，水500ml，CaCO310g，瓊脂20g，加熱溶解，用精密pH試紙調(diào)節(jié)pH到6.8，分裝入三角瓶后在103kPa121℃高壓蒸汽滅菌20Min。以無菌操作趁熱將(A)(B)

3、溶液均勻混合。2.藥品配制2.1結(jié)晶紫：結(jié)晶紫乙醇飽和液（結(jié)晶紫2g溶于20ml95%乙醇中）20ml，1%草酸氨水溶液80ml。將兩液混勻，放置24小時后過濾即可。2.2盧哥氏碘液：碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水300ml。先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸餾水300ml即成。2.3蕃紅溶液：番紅2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密閉的棕色瓶中。用時取20ml與80ml蒸餾水混勻即可。2.40.1%的呂氏美藍染液：A液：美藍0.3g，95%乙醇300ml；B液：0.01%KOH100ml?；旌螦和B液即成，按1：100稀釋即可。2

4、.4生理鹽水：稱取9g氯化鈉，溶解在少量蒸餾水中，稀釋到1000毫升。3.菌懸液的配制　　取1潔凈三角瓶，盛以225ml生理鹽水；7只潔凈試管，各盛9ml的生理鹽水；加塞包扎于在103kPa121℃高壓蒸汽滅菌20Min，得到無菌生理鹽水。將酸奶樣品攪拌均勻，用無菌移液管吸取樣品25ml加入盛有225ml無菌生理鹽水的三角瓶中，在旋渦均勻器上充分振搖，使樣品均勻分散，即為10-1的樣品稀釋液；　　將7只裝9ml生理鹽水的無菌試管，依次標記10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，再用無菌移液管吸10-1的菌懸液1ml放入依次裝有9ml無菌水的試

5、管中，稀釋混勻便得到10-2稀釋液，如此重復(fù)依次制得10-3～10-7的稀釋液。4.倒平板　　取無菌平板12個，編號標明10-1、10-5、10-6、10-7各三套；將經(jīng)高溫消毒的培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，按無菌操作法倒12只平板，每皿約15ml；平置使培養(yǎng)基均勻分布在皿底，待凝固。5.分離方法A．平板劃線　　接種環(huán)挑取10-1菌液，按無菌操作對標有”10-1”的3個平板進行劃操作；劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置放在40℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。B．平板涂布　　用三支1ml無菌移液管分別吸取10-5、10-6和10-7的稀釋菌懸液各1ml，對號接種于與之對應(yīng)的3個無

6、菌平板中，每個平皿放0.1ml；盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于試驗臺上20Min；然后倒置于40℃恒溫箱中培養(yǎng)48小時。6.脫脂乳試管的配制與滅菌　　直接選用脫脂乳液或按脫脂奶粉10克與蔗糖5克，水95克（蔗糖與水的比例在1：10的范圍內(nèi)）的比例配制，裝量以試管的1/3為宜，115℃滅菌15min。7.菌落觀察　　恒溫培養(yǎng)48小時過后，取出培養(yǎng)平板；選擇菌落分布較好的平板，先對其菌落形態(tài)進行觀察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大約1~3mm，園形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黃色；在產(chǎn)酸菌落周圍還能產(chǎn)生CaCO3的溶解圈。

7、40℃培養(yǎng)48h，如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步定為乳酸菌。8.乳酸菌的分離純化　　選取乳酸菌典型菌落轉(zhuǎn)致脫脂乳試管中，40℃培養(yǎng)8~24h若牛乳出現(xiàn)凝固，無氣泡，顯酸性，涂片鏡檢細胞桿狀或鏈球狀，革蘭氏染色顯陽性，則可將其連續(xù)傳代3次，最終選擇出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌種待用。9.乳酸發(fā)酵及檢查發(fā)酵：觀察BCG培養(yǎng)基中乳酸菌菌落特征，選取長勢比較好的菌落無菌操作下將乳酸菌接種于裝有脫脂乳的試管中，40～42℃靜止培養(yǎng)。取干凈載玻片一塊，在載玻片中央加一滴生理鹽水，無菌操作法取少量菌體涂片；結(jié)晶紫初染→碘液媒染→乙醇脫色→番紅復(fù)染，

8、干燥后用油鏡觀察，菌體被