乳酸菌的分離、純化與鑒定

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1、乳酸菌的分離、純化與鑒定第一部分：乳酸菌的分離、純化一、實(shí)驗(yàn)器材:1.實(shí)驗(yàn)藥品新鮮乳酸飲料（市售）、脫脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚綠乙醇溶液(溴甲酚綠、無(wú)水乙醇)、酵母膏、瓊脂、革蘭氏染液（結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、沙黃）、75%乙醇、香柏油、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、碳酸鈣；0.4gNaOH固體、4.2ml濃HCL(分析純)、20gCaCO3固體、酵母膏20g、瓊脂30g香柏油、脫脂奶粉100g、蔗糖10g；2.儀器與設(shè)備高壓蒸汽滅菌鍋、光學(xué)顯微鏡、培養(yǎng)箱、pH試紙、酸乳瓶、培養(yǎng)皿（φ9或φ12）、試管、300ml三角瓶（帶玻珠）、移

2、液管、天平、500ml錐形瓶、250ml錐形瓶、250ml燒杯。二、實(shí)驗(yàn)步驟：1.培養(yǎng)基配制（BCG牛乳培養(yǎng)基）：　　（A）溶液：取脫脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml，混合均勻后分裝入三角瓶于高壓蒸汽滅菌鍋80℃滅菌20min；（1.6%溴甲苯酚綠（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚綠加入20ml無(wú)水乙醇中，再加水至100ml制成）　?。˙）溶液：酵母膏10g，水500ml，CaCO310g，瓊脂20g，加熱溶解，用精密pH試紙調(diào)節(jié)pH到6.8，分裝入三角瓶后在103kPa121℃高壓蒸汽滅菌20Min。以無(wú)菌操作趁熱將(A)(B)

3、溶液均勻混合。2.藥品配制2.1結(jié)晶紫：結(jié)晶紫乙醇飽和液（結(jié)晶紫2g溶于20ml95%乙醇中）20ml，1%草酸氨水溶液80ml。將兩液混勻，放置24小時(shí)后過(guò)濾即可。2.2盧哥氏碘液：碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水300ml。先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸餾水300ml即成。2.3蕃紅溶液：番紅2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密閉的棕色瓶中。用時(shí)取20ml與80ml蒸餾水混勻即可。2.40.1%的呂氏美藍(lán)染液：A液：美藍(lán)0.3g，95%乙醇300ml；B液：0.01%KOH100ml。混合A和B液即成，按1：100稀釋即可。2

4、.4生理鹽水：稱(chēng)取9g氯化鈉，溶解在少量蒸餾水中，稀釋到1000毫升。3.菌懸液的配制　　取1潔凈三角瓶，盛以225ml生理鹽水；7只潔凈試管，各盛9ml的生理鹽水；加塞包扎于在103kPa121℃高壓蒸汽滅菌20Min，得到無(wú)菌生理鹽水。將酸奶樣品攪拌均勻，用無(wú)菌移液管吸取樣品25ml加入盛有225ml無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，在旋渦均勻器上充分振搖，使樣品均勻分散，即為10-1的樣品稀釋液；　　將7只裝9ml生理鹽水的無(wú)菌試管，依次標(biāo)記10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，再用無(wú)菌移液管吸10-1的菌懸液1ml放入依次裝有9ml無(wú)菌水的試

5、管中，稀釋混勻便得到10-2稀釋液，如此重復(fù)依次制得10-3～10-7的稀釋液。4.倒平板　　取無(wú)菌平板12個(gè)，編號(hào)標(biāo)明10-1、10-5、10-6、10-7各三套；將經(jīng)高溫消毒的培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，按無(wú)菌操作法倒12只平板，每皿約15ml；平置使培養(yǎng)基均勻分布在皿底，待凝固。5.分離方法A．平板劃線　　接種環(huán)挑取10-1菌液，按無(wú)菌操作對(duì)標(biāo)有”10-1”的3個(gè)平板進(jìn)行劃操作；劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置放在40℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。B．平板涂布　　用三支1ml無(wú)菌移液管分別吸取10-5、10-6和10-7的稀釋菌懸液各1ml，對(duì)號(hào)接種于與之對(duì)應(yīng)的3個(gè)無(wú)

6、菌平板中，每個(gè)平皿放0.1ml；盡快用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于試驗(yàn)臺(tái)上20Min；然后倒置于40℃恒溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)。6.脫脂乳試管的配制與滅菌　　直接選用脫脂乳液或按脫脂奶粉10克與蔗糖5克，水95克（蔗糖與水的比例在1：10的范圍內(nèi)）的比例配制，裝量以試管的1/3為宜，115℃滅菌15min。7.菌落觀察　　恒溫培養(yǎng)48小時(shí)過(guò)后，取出培養(yǎng)平板；選擇菌落分布較好的平板，先對(duì)其菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大約1~3mm，園形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黃色；在產(chǎn)酸菌落周?chē)€能產(chǎn)生CaCO3的溶解圈。

7、40℃培養(yǎng)48h，如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周?chē)囵B(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步定為乳酸菌。8.乳酸菌的分離純化　　選取乳酸菌典型菌落轉(zhuǎn)致脫脂乳試管中，40℃培養(yǎng)8~24h若牛乳出現(xiàn)凝固，無(wú)氣泡，顯酸性，涂片鏡檢細(xì)胞桿狀或鏈球狀，革蘭氏染色顯陽(yáng)性，則可將其連續(xù)傳代3次，最終選擇出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌種待用。9.乳酸發(fā)酵及檢查發(fā)酵：觀察BCG培養(yǎng)基中乳酸菌菌落特征，選取長(zhǎng)勢(shì)比較好的菌落無(wú)菌操作下將乳酸菌接種于裝有脫脂乳的試管中，40～42℃靜止培養(yǎng)。取干凈載玻片一塊，在載玻片中央加一滴生理鹽水，無(wú)菌操作法取少量菌體涂片；結(jié)晶紫初染→碘液媒染→乙醇脫色→番紅復(fù)染，

8、干燥后用油鏡觀察，菌體被