畢赤酵母高拷貝篩選、鑒定SOP

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1、畢赤酵母重組子高拷貝篩選.鑒定SOP一、儀器、培養(yǎng)基、耗材1?儀器恒溫培養(yǎng)箱PCR儀電泳儀2?培養(yǎng)基YPD固體/液體培養(yǎng)基MD培養(yǎng)基MM培養(yǎng)基3?耗材96孔板滅菌才簽二、實(shí)驗(yàn)操作1.高拷貝轉(zhuǎn)化子篩選需要三組各兩塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（共6塊）來篩選。通過持續(xù)接種，得到相同濃度的克隆子，以確保zR平板上細(xì)胞數(shù)相等。記住要有菌株背景對(duì)照及單拷貝基因?qū)φ?。一般?80個(gè)克隆，可選出1~5個(gè)髙拷貝克隆。1.1無菌條件下，將每個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上加入200plYPD：1.2用滅菌牙簽在第一組平板中每孔接種單個(gè)zR垂組子以及空白畢赤酵母X?33（GS115）、GS115/Albumin和GS11

2、5/pPICZ/lac乙輕輕攪動(dòng)以懸浮細(xì)胞，蓋住微量測(cè)定板30度孵育2天（不需搖動(dòng)）；1.3天后，取新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入190glYPD,用多道移液器吸取10

3、11培養(yǎng)液于第二組測(cè)定板中，30度孵育過夜（不需搖動(dòng)）；1.4第二天，取新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入190MYPD,用多道移液器吸取10

4、il培養(yǎng)液于第三組測(cè)定板中，30度孵育過夜（不需搖動(dòng)）；注意：如此，持續(xù)生長(zhǎng)及傳代可使克降達(dá)到相同細(xì)胞濃度1.5孵育后，取第三組板，用100卩1多道移液器上下吹打重新懸浮細(xì)胞;1.6取1?2小每孔中液體點(diǎn)在含zeocin濃度為0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml的Y

5、PD平板上；in用多道移液器或在平板底下劃線，確保以規(guī)則方式排列。1.7待液體吸收，將板放于30度，2?5天后檢測(cè)，分析結(jié)杲。也可選擇直接表達(dá)來看是否有克隆及人量表達(dá)口的蛋白。先檢測(cè)所有zR克降的Mu(+表型，ZR的ME表型重組子明顯大量表達(dá)蛋白，用southernblot分析拷貝數(shù)，確定拷貝數(shù)冃(確保劃線純化單克隆，并加入甘油冰凍保存zR抗性克隆,每次從凍存樣本中挑菌開始表達(dá)研究而不是從老的平板上挑菌)。2.Mut十表型菌株的篩選把篩選出的高拷貝重組子同時(shí)點(diǎn)在MD和MM兩塊板上。在MD和MM板上生長(zhǎng)差別不大的重紐子為MuF;相反，在MD±生長(zhǎng)快，MM±生長(zhǎng)很慢的重組子為Muts

6、,同時(shí)點(diǎn)酵母GS115/Albumin或KM71或KM71H(Muts)和X-33或GS115/pPICZ/lacZ(Mut+)菌落作對(duì)照，以便篩選時(shí)判斷高拷貝重組子的Mut+或Mutso3.畢赤酵母重組子的PCR及測(cè)序鑒定3.1搖菌挑取高拷貝轉(zhuǎn)化子單菌落于5mlYPD液體培養(yǎng)基屮，30°C250r/min振蕩培養(yǎng)過夜。3.2畢赤酵母基因組DNA提取煮?凍?煮法提畢赤酵母基因組DNA：取2.5.1培養(yǎng)的菌液1ml于1.5ml滅菌的EP管屮，2500Xg離心5min,棄上清，沉淀屮加入500卩1的PBS溶液懸浮沉淀，2500Xg離心3min；棄上清，沉淀溶于100（11TE,沸水浴

7、lOmin,?70°C冷凍30min,再次沸水浴lOmin,1500Xg離心5min,取上清為模板做PCR。注：實(shí)踐及文獻(xiàn)證明煮?凍?煮法提取酵母基因組效率較低，容易造成假陰性！天根公司酵母基因組提収試劑盒效果較好。3.3PCR擴(kuò)增鑒定①反應(yīng)體系:lOxBuffer5(1110mMdNTP3(il模板DNA2plPll

8、ilP2lplTaq酶IplMgCl24

9、ilddH2033.0pl總體積50.0pl②PCR反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性5min；94°C50s,55°C50s,72°C2min,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72°C延仲lOmin；4°C,oo。3.4PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳取

10、PCR產(chǎn)物5

11、11,1%瓊脂糖凝膠電泳，120V,30-50min,電泳結(jié)束，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。3.5PCR產(chǎn)物測(cè)序（可選做）電泳結(jié)果顯示DNA片段人小和目的基因分子量人小相一致的PCR產(chǎn)物,送上海生工測(cè)序及分析鑒定。