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1、烏骨藤多糖脫蛋白工藝的研究［摘要］目的優(yōu)選烏骨藤多糖脫蛋白工藝。方法以蛋白脫除率和多糖保留率為評價指標，考察酶-Sevage法對烏骨藤多糖脫蛋白的效果。結果酶-Sevage法的蛋白脫除率分別為75.09%,多糖保留率分別為89.83%。結論酶-Sevage法脫蛋白的方法可行。［關鍵詞］烏骨藤；多糖；脫蛋白［中圖分類號］R284.2［文獻標識碼］A［文章編號］2095-0616(2013)23-55-03烏骨藤為蘿？科牛奶菜屬植物通關藤Marsdeniatenacissima(Roxb.)WightetArn.的干燥藤莖，主產(chǎn)于云南、貴州，始載于《滇南木草》［1］。烏骨藤味苦，性微寒，具有清熱
2、解毒、止咳平喘、抗癌等功效，用于咽喉腫痛、肺熱咳喘和瘡癰癌腫，以烏骨藤制成的片劑和注射劑廣泛用于治療肝癌、胃癌、直腸癌等惡性腫瘤［2］,其抗腫瘤效果顯著。前期實驗證實,烏骨藤多糖具有抗腫瘤活性［3］,但有關其多糖的研究報道較少。為了對烏骨藤多糖的結構、空間螺旋構型及抗腫瘤活性進一步研究，本文對水提醇沉法制得多糖屮含冇的蛋白進行了分離，對其脫蛋白工藝進行了研究，選用酶-Sevage法脫蛋白，兼顧考慮蛋白脫除率和多糖保留率，優(yōu)化烏骨藤粗多糖脫蛋白方法，有關烏骨藤多糖脫蛋白的研究尚未見文獻報道。1材料烏骨藤購于安國杏林藥材公司，經(jīng)本校藥學院中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為蘿？科植物通關藤Marsde
3、niaLenacissimaCRoxb.）WightetArn.的藤莖，保存于遼寧中醫(yī)藥大學標本館中。紫外分光光度計（UV-1800型）；離心機（TDL-5-A）；電子天平（上海天平儀器廠）；pHih牛血清白蛋白（北京奧博星生物技術責任有限公司130225）；考馬斯亮藍G-250（國藥集團化學試劑有限公司）；木瓜蛋白酶（國藥集團化學試劑有限公司，6X106U/g）；葡萄糖；重精館苯酚、濃硫酸、三氯甲烷、正丁醇均為分析純。2方法2.1烏骨藤多糖的提取[4]取烏骨藤藥材250g,加6倍量95%乙醇回流提取2次，每次lh,過濾，藥渣揮干乙醇后加8倍量水100°C提取3次，每次2h,合并提取液，過濾
4、，濾液減壓濃縮至適當體積，加入95%乙醇使乙醇體積分數(shù)達到80%,靜置過夜，抽濾，沉淀用冇機溶劑洗滌，干燥得烏骨藤粗多糖。2.2烏骨藤多糖的含量測定[5]2.2.1葡萄糖標準溶液的制備精密稱取105°C干燥至恒重的葡萄糖10.12mg,置于lOOmL容量瓶中，加蒸憾水至刻度，搖勻，得到葡萄糖標準溶液。2.2.2標準曲線的制備精密量取葡萄糖標準溶液0.4、0?6、0?8、1?0、1.2、1.4mL置于10mL具塞試管中,加蒸傭水補足至加L,分別加入5%苯酚液l.OmL,充分搖勻，再加入濃硫酸5.OmL,搖勻，置于40°C水浴中反應15min,冷卻至室溫，490nm處測吸光度（A）,另取蒸憾水2
5、mL按上述顯色方法作為空白，以吸光度（A）為縱坐標，葡萄糖濃度（C）為橫坐標,得回歸方程:A二0.0608C-0.1281,r二0?9996。2.2.3樣品中多糖的含量測定精密吸取樣品溶液2.0mL,按“2.2.2”項下顯色方法進行操作，分別測定吸光度，計算樣晶屮多糖含量和多糖保留率，多糖保留率二脫蛋白后的多糖含量/脫蛋白前的多糖含量X100%o2.3烏骨藤多糖中蛋白質的含量測定[6]2.3.1蛋白質標準溶液的制備精密稱取牛血清蛋白10.04mg,置于100譏容量瓶中，加蒸館水至刻度，搖勻，得到蛋白質標準溶液。2.3.2標準曲線的制備精密吸取蛋白標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、l.O
6、mL置于10汕的具塞試管中，分別加入考馬斯亮藍染液5譏，加蒸飽水補足至6mL,搖勻，放置30min,另取蒸館水lmL按上述方法做空白，595nm處測定吸光度(A),以吸光度(A)為縱坐標，牛血清蛋白濃度(C)為橫坐標，得回歸方程：A二0.0347C+0.02,"0.9992。2.3.3樣甜屮蛋白質的含量測定精密吸取樣品溶液l.OmL,按"2.3.2”項下顯色方法進行操作，分別測定吸光度，計算樣品中蛋白質的含量和蛋白質脫除率，蛋白脫除率二(脫蛋白前蛋白質含量-脫蛋白后蛋白質含量)/脫蛋白前蛋白質含量X100%o2.4酶-Sevage法脫蛋白方法考察[7]精確配制0.02g/mL的烏骨藤多糖溶液
7、100mL,加入木瓜蛋白酶2g,搖勻，調節(jié)多糖溶液的pH值使pH二7,恒溫水浴40°C酶解lh,酶解結束后沸水浴lOmin滅活木瓜蛋白酶，離心除去變性蛋白沉淀，取上清液進行Sevage法脫蛋白，重復10次，測定蛋白脫除率和多糖保留率。3結果3.1結果分析采用酶法脫蛋白后聯(lián)合Sevage法脫蛋白，分析所得蛋白脫除率和多糖保留率，以Sevage法脫蛋白次數(shù)為橫坐標，分別以蛋白脫除率和多糖保留率為縱坐標繪圖，結果見
