時(shí)間分辨熒光免疫分析

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1、時(shí)間分辨熒光免疫分析分類體外分析中文名稱時(shí)間分辨熒光免疫分析正文吋間分辨熒光免疫分析(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是20世紀(jì)80年代初問世的一種超靈敏度的標(biāo)記免疫檢測技術(shù)。其主要特點(diǎn)是以鋼系元素錯(Eu3+)等標(biāo)記抗體或抗原為示蹤劑,利用增強(qiáng)液的熒光放大作用和時(shí)間分辨熒光法排除樣品或試劑中非特異性熒光物質(zhì)的干擾，最犬限度地提高了檢測方法的靈敏度和特異性，還具有量程寬，操作簡便，標(biāo)記物容易制備，穩(wěn)定性好，保存期長等諸多優(yōu)點(diǎn)。原理與放免分析相似，總體上分為競爭法和非競爭法兩類，前者多用于小分子半抗原，后者用于大分子化合物。鐮I系元素鍬

2、Eu)、彩(Sm)、鋪(Tb)和敘(Nd)通過雙功能螯合劑，在水溶液中很容易與抗原或抗體分子以共價(jià)雙鍵結(jié)合。經(jīng)抗原、抗體間特異性的免疫結(jié)合反應(yīng)，測定免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，就可推算待測物質(zhì)的濃度。鋼系離子的熒光信號極弱，需要在酸性條件下，解離出銅系離子，然后與熒光增強(qiáng)液中的β-二酮體生成新的螯合物,經(jīng)紫外光激發(fā)可產(chǎn)生強(qiáng)而持久的熒光信號，其增強(qiáng)效力可達(dá)100萬倍，故又稱解離增強(qiáng)鋼系熒光免疫分析(dissociation-ehanced-lanthanidefluoroimmunoassay,DELFI-A)。鋼系元素的發(fā)光時(shí)間延長，如Eu3+和Sm3+的熒光衰變時(shí)間分別

3、達(dá)到4.3×105ns和4?1×104ns,而樣品和試劑中的自然本底熒光的衰變時(shí)間僅為4~10ns,通過延遲測量時(shí)間，使信號不受本底熒光影響。此外，鋼系元素螯合物的激發(fā)光波長范用寬，發(fā)射光波長范圍窄，stokes位移大，有利于排除非特異性散射光的干擾，進(jìn)一步提高熒光信號的特異性。試劑組成1.Eu3¯標(biāo)記物可分為標(biāo)記抗體、標(biāo)記抗原，要求有較高的純度、比活性和免疫活性。密封后4°C或一20°C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。若發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)聚合，非特異性結(jié)合升高，則應(yīng)停止使用。2.固相抗體或抗原固相載體多用聚苯乙烯微孔條，要求透明度高，吸附性能好，材質(zhì)均勻，

4、孔間差異小，不同品牌其至不同批號的微孔條間都會有明顯的性能差異，應(yīng)引起注意。包被抗原純度要求高；包被抗體要求效價(jià)高，親和力強(qiáng)。包被后經(jīng)牛血清白蛋白封閉，干燥后在4°C、密封、避光、干燥的環(huán)境中保存。3?增強(qiáng)液試劑純度不高、器皿清潔度不良或不明原因的污染均可導(dǎo)致增強(qiáng)液熒光本底升高。因此必須注意試劑的純度；批號的差異，器皿要用10g/L的EDTA·Na2。溶液浸泡，再用三蒸水洗滌。新配制增強(qiáng)液應(yīng)用100ml塑料瓶在4°C下保存。4.校準(zhǔn)試劑或標(biāo)準(zhǔn)品指用生物液或緩沖液配制的一組不同濃度的待測物質(zhì)溶液，用于制作計(jì)量一反應(yīng)曲線或用作陰、陽性對照和cutoff值校準(zhǔn)。其濃度

5、已用法定標(biāo)準(zhǔn)物為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)定，標(biāo)示值與實(shí)測值的偏差不得超過士10%。蛋白質(zhì)類生物活性物質(zhì)應(yīng)進(jìn)行免疫活性測定，證明其同質(zhì)性。4°C或一20°C保存。5?質(zhì)量控制樣品檢測步驟以Wallac公司autoDELFIA全自動時(shí)間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)測定hTSH為例，其免疫反應(yīng)原理為雙抗體夾心法，全部試驗(yàn)過程均在autoDELFIA全自動時(shí)間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)上按預(yù)設(shè)程序自動完成，整個檢測過程用時(shí)約2?5h左右。步驟如下：（1）將100μl樣品或標(biāo)準(zhǔn)品按順序加入抗體包被的微孔條中。（2）每孔加入100μl稀釋過的Eu3+標(biāo)記抗體工作液。⑶孵育2ho⑷洗滌6次，除去游離Eu3

6、+標(biāo)記抗體。（5）每孔加增強(qiáng)液200μl,反應(yīng)5mino（6）測定熒光強(qiáng)度并經(jīng)數(shù)據(jù)處理計(jì)算待測物質(zhì)濃度。資料保存及報(bào)告要求所有原始記錄應(yīng)妥善保存，以被查考。報(bào)告內(nèi)容包括患者姓名、編號、項(xiàng)目、送檢H期、測定日期、測定結(jié)果和正常參考值，推薦使用計(jì)算機(jī)管理系統(tǒng)對資料進(jìn)行儲存、分類、查詢、報(bào)告、收費(fèi)和制作統(tǒng)計(jì)報(bào)表。質(zhì)量控制質(zhì)量控制的目的就是對分析工作的誤差進(jìn)行經(jīng)常性的檢查，遇有質(zhì)量異常則及時(shí)采取對策，以保證分析誤差控制在可接受的范圍內(nèi)O放射免疫分析的質(zhì)控包括實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)控和實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)控兩個方面。前者是一個實(shí)驗(yàn)室對本身的分析質(zhì)量進(jìn)行檢查和控制，后者則由地區(qū)性或全國性機(jī)構(gòu)就一些項(xiàng)目

7、對各實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果進(jìn)行比較，得到共性或個性的信息，提供行政主管、生產(chǎn)廠家、各有關(guān)實(shí)驗(yàn)室參考。1.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)控的主要內(nèi)容實(shí)驗(yàn)誤差分兩大類：隨機(jī)誤差及系統(tǒng)誤差。前者的出現(xiàn)純屬隨機(jī)現(xiàn)象，例如因各樣品加樣、分離、測量等步驟的差異引起復(fù)管差異過大。后者的出現(xiàn)則是由于整批實(shí)驗(yàn)發(fā)生了某一系統(tǒng)變化，使很多樣品受到類似的影響，例如標(biāo)準(zhǔn)品濃度不準(zhǔn)或待測樣品所用加樣器不準(zhǔn)，結(jié)果所有待測樣品都偏低或偏高。隨機(jī)誤差是不可避免的，只能將之控制在可接受的范圍內(nèi)，而系統(tǒng)誤差則是可以而且應(yīng)當(dāng)設(shè)法避免的。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控就是要對這兩類誤差進(jìn)行