產(chǎn)前診斷中的基因檢測

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1、產(chǎn)前診斷中的基因檢測四川省婦幼保健院生殖中心；四川省計(jì)劃生育科研所遺傳室　李運(yùn)星　以簡煉的方式介紹產(chǎn)前診斷基因水平診斷的技術(shù)方法，并加以常見的病例給予說明，值得基層的產(chǎn)前診斷與優(yōu)生優(yōu)育工作者一閱?！　』驒z測在產(chǎn)前診斷中是十分重要，且正在不斷發(fā)展與完善，其實(shí)質(zhì)是在DNA水平或RNA水平對某一基因進(jìn)行分析，從而對特定的疾病進(jìn)行診斷?；蛟\斷始于1978年，美國科學(xué)家首先將限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）用于基因診斷，從而揭開了基因診斷的序幕，基因診斷不僅可以明確指定個體是否患病，存在基因缺陷并揭示基因

2、狀態(tài)，而且可以對表型正常的攜帶者、對某種疾病的易感者作出診斷和預(yù)測。分子遺傳檢測技術(shù)大致可分為酶譜分析法、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、探針雜交分析法、DNA測序等方法。實(shí)際上，臨床上多將這幾種技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于基因檢測。9一、限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）　　人群中不同個體基因的核苷酸序列存在差異，稱為DNA多態(tài)性。DNA順序上發(fā)生變化而出現(xiàn)或丟失某一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，使酶切產(chǎn)生的片段長度和數(shù)量發(fā)生變化稱為RFLP。任何一個基因內(nèi)

3、切大片段的缺失、插入以及基因重排，即使不影響到限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的丟失或獲得，也很可能引起限制性內(nèi)切酶圖譜的變化，使限制性內(nèi)切酶片段的大小和數(shù)量發(fā)生變化，因而這類基因突變可以通過限制性內(nèi)切酶DNA或結(jié)合基因探針的雜交方法將突變找出?！　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　±纭　?.鐮形紅細(xì)胞貧血癥的基因診斷：　　　　　　　　　　　　　9　　已知鐮形紅細(xì)胞貧血癥的突變基因是編碼β珠蛋白鏈的第6位密碼子由GAG變?yōu)镚TG，可用限制性內(nèi)切酶MstⅡ進(jìn)行檢測。因?yàn)檫@一突變使正常存在的MstⅡ切點(diǎn)消失，這

4、就使正常情況下存在的1.1kb及0.2kb條帶變成患者（純合子）的1.3kb條帶?！?.血友病A的診斷　血友病A是一種X連鎖隱性遺傳病。用VⅢ因子基因的cDNA片段作為探針對待檢者DNA酶切片段進(jìn)行雜交，就可檢出VⅢ因子基因部分缺失的男性患者和女性攜帶者。下圖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　9　　　　　家系Ⅲ-1患有嚴(yán)重的血友病A，經(jīng)VⅢ因子治療后產(chǎn)生VⅢ因子抑制物。用兩種不同的內(nèi)切酶和探針組合對家系成員作RFLP分析。應(yīng)用BclI/探針B（VⅢ因子基因）VⅢ因子基因部分缺失所致血友病A的基

5、因診斷　　探針A是VⅢ因子基因1.7kbKpnIcDNA片段，包括1～12外顯子?！　√结楤是VⅢ因子基因4.7kbEcoRIcDNA片段，包括14～25和部分26外顯子。A、B、C、D代表X染色體。　　患者無Bcl/探針1.2和4.4bk,但有SstI/探針A14.5kb、4.7kbEcoRIcDNA片段，包括14～25和部分26外顯子，患者不見1.2kb和4.4kb。應(yīng)用SstI/探針A（因子基因1.7kbKpnIcDNA片段，包括1～12外顯子），患者和他的母親（必然雜合子）出現(xiàn)異常的14.5

6、kb。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VⅢ因子基因3’端部分缺失后，其5’端殘留部分可由SstI/探針A檢出。雜合子兼有BclI/探針B檢出的1.2kb和4.4kb與SstI/探針檢出的14.5kb。二、PCR技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用特點(diǎn)　　1983年KaryMullis發(fā)明了PCR技術(shù)。這項(xiàng)生命科學(xué)發(fā)展史上具劃時代意義的技術(shù)一出現(xiàn)，首先就被分子遺傳學(xué)家應(yīng)用于幾種常見的人類單基因遺傳病的基因診斷、攜帶者檢查和產(chǎn)前診斷，例如鐮形紅細(xì)胞貧血?。⊿icleCellAnemia）、地中海貧血（Thalassemia）

7、、DMD/BMD（進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良）、血友?。℉emophilia）等等。我國1987年啟動的國家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃（863），對遺傳病的基因診斷及相關(guān)新技術(shù)的研究結(jié)予了支持，及時擁有國際先進(jìn)技術(shù)，完成了多項(xiàng)重要研究課題，獲得了一大批科研成果。當(dāng)時已完成了十多種遺傳病的三十多例高危胎兒的產(chǎn)前基因診斷?！　∫曨l：PCR原理(讓我們用動畫了解)9　　PCR技術(shù)被稱為試管里的基因克隆術(shù)，靶基因片段以2n的指數(shù)形式迅速增加（n代表循環(huán)數(shù)）。30個熱循環(huán)后，靶DNA拷貝數(shù)就擴(kuò)增上百萬倍之多！而這僅僅需要約2～3個

8、小時。PCR反應(yīng)結(jié)束后，運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯膠電泳（PAGE,polyacrylamidegelelectrophoresis）進(jìn)行PCR產(chǎn)物的分離分析，經(jīng)溴乙啶（EB）染色或銀染，即能觀察到特定長度的DNA區(qū)帶圖譜。根據(jù)圖譜即可作出基因診斷，也可對PCR產(chǎn)物進(jìn)一步酶切，克隆或直接測序。值得指出的是，PCR并不僅僅是一個簡單的DNA擴(kuò)增反應(yīng)，而是一項(xiàng)可以作出千變?nèi)f化的改造，從而衍生出許許多多反應(yīng)，運(yùn)用于各種不同的研究和基因檢測之中?！　∥覈碌刂泻Ｘ氀怯捎谖挥?/p>