HPV疫苗的制備-馬小艮.doc

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1、HPV疫苗的制備及作用效果HPV是一類能夠感染皮膚和粘膜的DNA病毒。高危型HPV是宮頸癌以及癌前病變的要致病因子，99.7%的宮頸癌組織都檢測(cè)出高危型HPV。針對(duì)HPV感染，人類自身所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答主要分為體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫主要表現(xiàn)為HPV刺激機(jī)體B細(xì)胞產(chǎn)生抗HPVL1、L2蛋白的抗體，但是由于產(chǎn)生抗體的量特別少，所以很難檢測(cè)到這些特異性抗體，阻礙了人們對(duì)體液免疫的相關(guān)研究。細(xì)胞免疫主要表現(xiàn)為T細(xì)胞受HPV刺激后通過(guò)釋放淋巴因子來(lái)殺死感染病毒的細(xì)胞[1,2]。目前預(yù)防和治療HPV相關(guān)癌癥最有效的方法是研制其特異性的HPV疫苗，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生

2、中和抗體，激發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)，以達(dá)到預(yù)防HPV相關(guān)癌癥發(fā)生和傳播的目的，既可以降低宮頸癌的發(fā)病率，也可降低與HPV感染有關(guān)的其它癌癥的發(fā)病率。人類乳頭瘤病毒（HPV）是一種無(wú)包膜的雙鏈閉環(huán)小分子DNA病毒，屬乳頭多瘤空病毒科乳頭瘤病毒屬。其基因約8kb，只有1條DNA鏈可作為轉(zhuǎn)錄模板，含8個(gè)開(kāi)放閱讀框（openreadingframes，ORFs），分3個(gè)基因區(qū)，即早期區(qū)(earlyregion，E區(qū))、晚期區(qū)（lateregion，L區(qū)）與非編碼區(qū)（uncodingregion，UCR）或上游調(diào)控區(qū)（URR）。E區(qū)編碼E1，E2，E4，E5，E6，

3、E7等早期蛋白，參與病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控和轉(zhuǎn)化等功能；L區(qū)編碼主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2；UCR區(qū)含有HPV基因組復(fù)制起點(diǎn)和HPV表達(dá)所必需的調(diào)控元件。由ＨＰＶ產(chǎn)生的兩種癌蛋白是Ｅ6和Ｅ7，可以抑制細(xì)胞周期負(fù)調(diào)節(jié)因子的活性，并可以在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)。而晚期基因則編碼衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白，其中主要衣殼蛋白Ｌ1結(jié)構(gòu)保守，是ＨＰＶ衣殼的主要成分，約占衣殼蛋白的80%以上，因此成為理想的預(yù)防免疫靶位?；贖PV的致病機(jī)制和天然的免疫原性，HPV疫苗研究聚焦于L1、E2、E5、E6和E7。目前HPV的疫苗主要分為預(yù)防性疫苗和治療性疫苗。預(yù)防性疫

4、苗主要誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的中和性抗體在HPV進(jìn)入機(jī)體前即能與病毒的抗原結(jié)合，從而防止HPV的感染。治療性疫苗主要引起機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的活化效應(yīng)性T細(xì)胞能識(shí)別和攻擊HPV感染的細(xì)胞，其中也包括HPV引起的惡性腫瘤細(xì)胞。（一）HPV預(yù)防性疫苗1.預(yù)防性疫苗的制備依據(jù)及過(guò)程預(yù)防性疫苗一般以HPV主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2為靶抗原[3],其作用在于誘發(fā)肌體產(chǎn)生特異性的中和抗體和有效的局部免疫反應(yīng),以阻止HPV的長(zhǎng)期感染和再感染。HPV的衣殼蛋白在真核以及原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時(shí),能自我裝配或形成病毒樣顆粒(virus-likepartic

5、les,VLPs),其結(jié)構(gòu)和抗原表位與天然的病毒顆粒十分相似，將其置入機(jī)體后可刺激產(chǎn)生中和抗體IgG和IgA[4]，達(dá)到預(yù)防相應(yīng)型別HPV的感染，而且不包括病毒DNA，安全性好，能有效地保護(hù)人類和動(dòng)物免受乳頭瘤病毒的感染以及產(chǎn)生相關(guān)腫瘤的可能性[5,6]。VLPs顆粒直徑為50-55nm，分子量為55-60kDa，VLPs是由純化的L1蛋白裝配形成HPV的空衣殼。VLPs的最小結(jié)構(gòu)單元是L1蛋白單體，L1蛋白主要是由8條反向平行的β折疊肽鏈段構(gòu)成的，它們之間是由無(wú)規(guī)則的環(huán)形區(qū)（loop）連接在一起的，每個(gè)環(huán)形區(qū)大約有10~30個(gè)氨基酸（aa），這些區(qū)

6、域絕大部分延伸到五聚體和病毒顆粒的外表面，是抗原表位的所在區(qū)域[7-9]；不同型別HPV環(huán)形區(qū)的序列和空間結(jié)構(gòu)是不同的，所以HPV具有高度的型別特異性。因此，目前對(duì)于HPV抗原表位的研究主要集中在L1蛋白的環(huán)形區(qū)上[10]。國(guó)內(nèi)外有多家機(jī)構(gòu)在進(jìn)行HPV疫苗的研究及其制備，大部分都是以L1和（或）L2蛋白為靶標(biāo)進(jìn)行制備的（單獨(dú)表達(dá)L1或者聯(lián)合表達(dá)L1+L2，獲得病毒樣顆粒(VLP)）。一般步驟都是針對(duì)HPVL1和（或）L2蛋白的核酸序列為基礎(chǔ)，對(duì)其進(jìn)行改造優(yōu)化（例如密碼子優(yōu)化，刪除部分序列，替換某個(gè)/些堿基，連接其他基因等），擴(kuò)增或者合成優(yōu)化后的序列，

7、然后將其克隆到表達(dá)載體上，并在原核系統(tǒng)（例如大腸桿菌）或者真核系統(tǒng)（例如昆蟲細(xì)胞，酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）進(jìn)行表達(dá)，再將表達(dá)的單個(gè)蛋白或者融合蛋白分離純化，添加佐劑后制成疫苗，通過(guò)將制成的疫苗免疫小鼠或者其他動(dòng)物對(duì)其免疫原性進(jìn)行評(píng)價(jià)，效果較好的進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)。2.已經(jīng)被批準(zhǔn)上市的預(yù)防性疫苗目前已經(jīng)被批準(zhǔn)上市的預(yù)防性HPV疫苗有兩種，它們分別是英國(guó)葛蘭素（GlaxoSmithKline，GSK）公司的雙價(jià)疫苗“Cervarix”和美國(guó)默克（Merck&Co.,Inc.）公司生產(chǎn)的四價(jià)疫苗“Gardasil”（商品名）[11]。隨著這兩種疫苗的上市，人們對(duì)宮

8、頸癌疫苗的研究主要集中在HPVVLPs疫苗上。2006年，“Gardasil”被批準(zhǔn)上市，這是第一個(gè)商品化的