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1、周智芝：新城疫病毒誘導(dǎo)人耐順鉑A549肺癌細(xì)胞凋亡的研究!新城疫病毒誘導(dǎo)人耐順鉑A549肺癌細(xì)胞凋亡的研究研究生：周智芝導(dǎo)師：孟松樹副教授中文摘要順鉑(Cisplatin,DDP)是一種療效顯著的抗腫瘤藥物，對(duì)多種實(shí)體瘤均具有較好的臨床療效，因此被廣泛應(yīng)用于癌癥的化療。然而，腫瘤細(xì)胞極易對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥，常導(dǎo)致化療失敗，限制了順鉑的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究新城疫病毒(Newcastlediseasevires，NDV)對(duì)人耐順鉑肺癌細(xì)胞(A549／DDP)的體內(nèi)外溶瘤作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，NDV能特異而高效地在A549／D
2、DP和A549細(xì)胞中增殖，且在A549／DDP細(xì)胞中的增殖能力更強(qiáng)，但不能在正常細(xì)胞中復(fù)制。NDV通過激活caspase依賴的細(xì)胞凋亡通路、MAPK通路和Akt通路誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的A549／DDP細(xì)胞凋亡，且對(duì)A549／DDP荷瘤裸鼠具有顯著的溶瘤效果。本實(shí)驗(yàn)首次研究了NDV對(duì)耐藥肺癌細(xì)胞的溶瘤機(jī)制，結(jié)果表明溶瘤新城疫病毒在臨床治療順鉑耐藥肺癌中具有重要的應(yīng)用前景。取得的研究結(jié)果如下：1．采用TCID50法測(cè)定病毒滴度，結(jié)果表明NDV(FMW株)能特異而高效地在人耐順鉑肺癌細(xì)胞(A549／DDP)中增殖，且較在其親本肺癌細(xì)胞(A
3、549)中的增殖能力更強(qiáng)，但不能在MRC．5人胚肺成纖維細(xì)胞中增殖。2．FACS(AnnexinV／PI雙染法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明FMW感染能夠誘導(dǎo)A549／DDP細(xì)胞凋亡，該凋亡過程對(duì)于FMW感染具有時(shí)間依賴性。3．Hoechst33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞核均呈彌散均勻的橢圓狀。FMW感染組部分細(xì)胞核切割成大小不等的致密濃染碎塊，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征，進(jìn)一步顯示FMW感染引起A549／DDP細(xì)胞凋亡。4．WesternBlot檢測(cè)凋亡相關(guān)通路的活化，結(jié)果表明FMW感染激活caspase通路，其中
4、caspase．8介導(dǎo)的外源性凋亡通路起主要作用，此外，MAPK通路和Akt通路也被激活。5．采用pan—caspase抑制劑Z-VAD—FMK(50州)預(yù)處理A549／DDP細(xì)胞后再感染FMW，F(xiàn)ACS(AnnexinV／PI雙染法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡被明顯抑制，表明FMW誘導(dǎo)的A549／DDP細(xì)胞凋亡依賴于caspase的激活。6．分別用Erkl／2、Jnk、p38和Akt通路特異性抑制劑PD98059(20gM)、SP600125(10肛M)、2一SB203580(10“M)或LY294002(10肛M)預(yù)處理細(xì)
5、胞后再感染FMW，MTT法分析細(xì)胞殺傷率。結(jié)果顯示，抑制MAPK和Akt通路均能抑制FMW誘導(dǎo)的A549／DDP細(xì)胞凋亡，表明MAPK和Akt通路參與該凋亡過程。7．H&E染色、TUNEL法分析荷瘤裸鼠腫瘤石蠟切片，發(fā)現(xiàn)未感染組細(xì)胞基本未見凋亡，而FMW感染組細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡特征，表明FMW能誘導(dǎo)A549／DDP或A549荷瘤裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡。8．采用QRT-PCR分析FMWM基因表達(dá)并以TCID50法測(cè)定病毒滴度，研究FMW在荷瘤裸鼠瘤內(nèi)復(fù)制能力。結(jié)果表明FMW能在A549／DDP或A549荷瘤裸鼠瘤內(nèi)特異地高效復(fù)制，且在
6、A549／DDP移植瘤中復(fù)制能力更強(qiáng)。9．測(cè)量并計(jì)算荷瘤裸鼠腫瘤體積，采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)MW顯著抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)A549／DDP及A549移植瘤的抑瘤效果相近，且能夠延長(zhǎng)荷瘤裸鼠生存期。本實(shí)驗(yàn)首次研究了NDV對(duì)耐藥肺癌細(xì)胞的溶瘤作用，證明NDV通過激活caspase通路、MAPK通路和Akt通路而有效誘導(dǎo)耐順鉑肺癌細(xì)胞凋亡，較好地克服了順鉑耐藥導(dǎo)致的凋亡下調(diào)，對(duì)體外培養(yǎng)的A549／DDP細(xì)胞和A549／DDP荷瘤裸鼠均具有顯著的溶瘤效果。本實(shí)驗(yàn)從全新的角度研究了NDV的溶瘤機(jī)制，表明NDV有望成
7、為一種治療順鉑耐藥肺癌的理想制劑。關(guān)鍵詞：新城疫病毒；順鉑；細(xì)胞凋亡；MAPK；Akt周智芝：新城疫病毒誘導(dǎo)人耐順鉑A549肺癌細(xì)胞凋亡的研究Newcastlediseasevirusinducesapoptosisincisplatin．resistanthi’adenoc",maA549cellshumanlung[aenocarcmomaAft49cells一1／／W五陽(yáng)annUIWVO●●．■●Candidate：ZhouZIlizhiSupervisor：associateProf．MengSongshuAbstra
8、ct3一Cisplatin(DDP)isapowerfulanti-cancel"drugwidelyusedinlungCanCel"chemotherapy．However,cisplatinresistancedeveloppedincancercellsweakene
