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《體外大鼠腸道菌群代謝脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的研究.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、第4O卷分析化學(xué)(FENXIHUAXUE)研究報(bào)告第1期2012年1月ChineseJournalofAnalyticalChemistryll9～123DOI：10．3724／SP．J．1096．2012．10208體外大鼠腸道茵群代謝脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的研究馮培生沈建忠吳海霞李林霞戴燕玉劉凱麗王瑩張素霞(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100193)摘要運(yùn)用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿／飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC—Q／TOF—Ms)識(shí)別和確定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynialenol，DON)在大鼠腸道菌群體外代謝模
2、型中的代謝產(chǎn)物，同時(shí)運(yùn)用高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜定量分析DON含量變化，比較各段腸管中厭氧菌群的代謝能力。結(jié)果表明，DON不能被大鼠小腸菌群代謝，而能被其大腸菌群代謝為脫環(huán)氧代謝產(chǎn)物脫環(huán)氧一脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deepoxy-deoxynialenol，DOM)。定量測(cè)定結(jié)果顯示，大腸中盲腸菌群代謝能力最強(qiáng)。關(guān)鍵詞體外代謝；腸道菌；大鼠；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿／飛行時(shí)間質(zhì)譜1引言脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynialenol，DON)，化學(xué)名為3d，7a，15一三羥基一12，13一環(huán)氧
3、單端孢霉一9_烯一8一酮，俗稱(chēng)嘔吐毒素，屬于B型單端孢霉烯醇類(lèi)毒素。DON是由鐮刀菌屬中的禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1?！?。DON能夠引起動(dòng)物增重下降、食欲減退、營(yíng)養(yǎng)吸收率降低、嘔吐等慢性毒性作用；對(duì)真核細(xì)胞和原核細(xì)胞均具有明顯的細(xì)胞毒性；DON能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡、抑制其增殖，同時(shí)還影響免疫細(xì)胞因子的分泌口】。通常，毒性物質(zhì)經(jīng)體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化后毒性會(huì)降低，然而有時(shí)生物轉(zhuǎn)化后會(huì)形成毒性增強(qiáng)的代謝產(chǎn)物。利用氣相色譜一質(zhì)譜(GC—MS)已研究DON多種動(dòng)物模型，但僅識(shí)別和鑒定出一種工相代謝產(chǎn)物脫環(huán)氧一脫氧雪
4、腐鐮刀菌烯醇(Deepoxy—deoxynialenol，DOM)]。眾所周知，在代謝產(chǎn)物研究中液相色譜一質(zhì)譜(LC—MS)已成為最合適、最有效的分析方法。本研究運(yùn)用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿／飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC～Q／TOF—MS)分析DON在大鼠腸道厭氧菌群體外代謝模型中代謝產(chǎn)物，同時(shí)利用高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜(LC-MS／MS)比較各段腸管代謝能力的強(qiáng)弱。UPLC—Q／TOF—MS結(jié)合了超高效液相色譜提供的更快、更靈敏的色譜分離能力和四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)測(cè)定優(yōu)勢(shì)[9~11】，借助代謝產(chǎn)物識(shí)別
5、軟件Metabolynx自動(dòng)分析采集樣品信息，特別是質(zhì)量缺失過(guò)濾(Massdefectfilter,MDF)的應(yīng)用能有效剔除假陽(yáng)性結(jié)果，從而提高分析效率1。2實(shí)驗(yàn)部分2．1儀器、試劑與動(dòng)物ACQUITYTM超高效液相色譜(配AcquityBEHC8色譜柱)，Alliance2690高效液相色譜(fl~SymmetryRPC。色譜柱)，SYNAPTTM四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(美國(guó)Waters公司)；Quattro三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜(英國(guó)Micromass公司)；Bactrom厭氧培養(yǎng)箱(美國(guó)Shellab公司)；AUe
6、gra64R臺(tái)式高速離心機(jī)(美國(guó)Becrman公司)；氮吹儀(美國(guó)OrganomationAssociates公司)；旋渦混合器(北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司)。DON標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99％，以色列Fermentek公司)，乙酸乙酯(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙腈(農(nóng)殘級(jí)，美國(guó)Fisher公司)，氨水(28％，美國(guó)Alfa-Aesar公司)，厭氧培養(yǎng)基(北京陸橋有限責(zé)任公司)，超純水由Milli—Q純水儀(美國(guó)Millipore公司)自制。Wistar大鼠(體重220~250g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公
7、司)，禁食12h，自由飲水。201卜O3一O7收稿；201卜05-29接受本文系“973”國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃課題(No．2009CB118801)資助E—mail：suxia@cau．edu．cn120分析化學(xué)第40卷2．3實(shí)驗(yàn)方法2．3．1大鼠腸道厭氧菌群培養(yǎng)液制備大鼠脫椎致死后迅速打開(kāi)腹腔，分離腸管，轉(zhuǎn)移至厭氧培養(yǎng)箱中。在培養(yǎng)箱中取出腸道內(nèi)容物，按1：15(re~V)比例加入?yún)捬跖囵B(yǎng)基溶液，用四層紗布過(guò)濾獲得厭氧菌群培養(yǎng)液。2．3．2DON在厭氧菌群中孵育條件厭氧培養(yǎng)箱中混合氣組成為5％H，5％CO：和
8、90％N：。培養(yǎng)溫度設(shè)為37℃。10DON標(biāo)準(zhǔn)溶液(2．5g／L)加入5mL大腸或小腸厭氧菌群培養(yǎng)液中，陰性對(duì)照中加入等體積的甲醇。厭氧環(huán)境中，37℃孵育24h后，一20℃冷凍保存；10DON標(biāo)準(zhǔn)溶液(2．5g／L)加入8mL盲腸、結(jié)腸或直腸厭氧菌群培養(yǎng)液中，37℃孵育0，2，4，8，12和24h后，吸取1mL孵育液于1．5mL離心管中，一20℃冷凍保存。2．3．3樣品預(yù)
