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《土壤酶活性測(cè)定方法2016.04.20.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、土壤脲酶（urease）活性的測(cè)定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的測(cè)定是以尿素為基質(zhì)，酶促水解生成的氨與酚類化合物起反應(yīng)生成藍(lán)色的靛酚，顏色深度與氨含量相關(guān)，因而用于脲酶活性的測(cè)定。（二）試劑1）甲苯2）10%尿素：稱取10g尿素，加蒸餾水90ml。3）檸檬酸鹽緩沖液（PH6.7）：取184g檸檬酸溶于300ml蒸餾水中，另取147.5gKOH溶于蒸餾水，再將二種溶液合并，用1NNaOH將pH調(diào)節(jié)至6.7，用水稀釋至1L。4）苯酚鈉溶液（1.35mol/L）：A．62.5克苯酚溶于少量乙醇，加
2、2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀釋至100毫升（A液），存于冰箱中；B.27克NaOH溶于100毫升水（B液）,存于冰箱中。將A、B溶液保存在冰箱中。使用前將兩種溶液各20ml混合，用蒸餾水稀釋至100ml。5）次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至活性氯的濃度為0.9%，溶液穩(wěn)定。6）氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.4717克硫酸銨溶于水并稀釋至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液（100ppm）。（三）測(cè)定步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即為10ppm，吸取0、1
3、、2、3、4、5、10、15、20mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚鈉，仔細(xì)混合，加入3mL次氯酸鈉，充分搖蕩，放置20分鐘,用水稀釋至刻度。即為0、0.2ppm、0.4ppm、0.6ppm、0.8ppm、1ppm、2ppm、3ppm、4ppm的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將著色液在紫外分光光度計(jì)上于578nm處進(jìn)行比色測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以光密度值為縱坐標(biāo)繪制曲線圖。（2）土壤中脲酶活性的測(cè)定稱取10g土壤置于100ml容量瓶中。用2mL甲苯處理15分鐘。往瓶中加入10mL10%尿素溶液和2
4、0mL檸檬酸緩沖液（pH6.7）。仔細(xì)混合后，將瓶放在37℃恒溫箱中，放置24h。之后用38℃水定容至100ml（甲苯浮在刻度線上）。與此同時(shí)，進(jìn)行以水代替基質(zhì)（10ml10%尿素用10ml蒸餾水代替），及無土對(duì)照測(cè)定。培養(yǎng)結(jié)束后，將懸液過濾。吸取3mL（視情況而定）濾液于50mL容量瓶中，用蒸餾水加至10mL。然后按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的操作加入苯酚鈉等試劑，顯色，比色，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出氨態(tài)氮含量。以每克土壤在37℃下24h內(nèi)酶解尿素釋放的NH3-N的毫克數(shù)來表示脲酶活性。過氧化氫酶測(cè)定(容量法)1.試劑配制
5、a.0.3％過氧化氫溶液：將10ml30%的過氧化氫用水稀釋至1L，此溶液不穩(wěn)定，需臨時(shí)配置。b.1.5mol/L硫酸：8.4ml濃硫酸溶于水，再用蒸餾水稀釋至100mlc.0.002mol/LKMnO4溶液：稱取化學(xué)純高錳酸鉀0.3161g，溶于1升蒸餾水中，貯于棕色瓶中，備用。如果知道酶活性很高的話可以適當(dāng)變化高錳酸鉀濃度2.操作步驟（1）取5g過1mm風(fēng)干土，置于150mL三角瓶中，并注入40mL蒸餾水和5mL0.3％H2O2溶液。（2）同時(shí)設(shè)置對(duì)照，即三角瓶中注入40mL蒸餾水和5mL0.3％過氧化
6、氫溶液，而不加土樣。并作無土對(duì)照。（3）將三角瓶放在振蕩機(jī)上振蕩（120r/min）30min后，加入5mL1.5mol/L硫酸，以穩(wěn)定未分解的過氧化氫。再將瓶中懸液用慢速濾紙過濾。吸取25mL濾液，用0.002mol/L高錳酸鉀滴定至淡粉紅色終點(diǎn)（30s不退色）。3.結(jié)果計(jì)算以單位土重消耗的0.002mol/L高錳酸鉀毫升數(shù)（對(duì)照與試驗(yàn)測(cè)定的差）表示土壤過氧化氫酶活性，其計(jì)算式為：土壤過氧化氫酶活性（mlKMnO4/g干土）=(V0-V)/m式中，V0為滴定空白所消耗的高錳酸鉀毫升數(shù)（ml）V為滴定試樣所
7、消耗的高錳酸鉀毫升數(shù)（ml）；m為烘干土壤重量（g）。高錳酸鉀溶液標(biāo)定：吸取2ml0.1N草酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液于200ml三角瓶中，并加水至80ml左右，投入幾粒玻璃珠，再加5ml1:3的硫酸酸化，在電爐上加熱2min，取下稍冷，趁熱（70-80度）用高錳酸鉀溶液滴定，滴至為紅色（30s不退色）即達(dá)到終點(diǎn)，記下高錳酸鉀的毫升數(shù)（V）。高錳酸鉀溶液標(biāo)準(zhǔn)濃度按下式計(jì)算c（1/5KMnO4）=m/（V1-V2）*0.06700式中：c（1/5KMnO4）—高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度，mol/L；m—草酸鈉之質(zhì)量，g；
8、V1—高錳酸鉀溶液之用量，mL；V2—空白試驗(yàn)用高錳酸鉀溶液之用量，mL；0.06700—與1.00mL高錳酸鉀溶液c（1/5KMnO4）=1.000mol/l相當(dāng)?shù)囊钥吮硎镜牟菟徕c的質(zhì)量。土壤磷酸酶測(cè)定方法：磷酸苯二鈉比色法磷酸酶(phosphatase)能酶促有機(jī)磷化合物的水解。試驗(yàn)表明，土壤微生物對(duì)于土壤含磷有機(jī)物的礦化起著主要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力狀況
