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《DB37T 3319-2018 水貂、狐和貉犬瘟熱病毒等10種病毒性病原實(shí)時熒光PCR檢測方法.doc》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、ICS?65.020.30B41?????DB37山東省地方標(biāo)準(zhǔn)DB37/T3319—2018?????水貂、狐和貉犬瘟熱病毒等10種病毒性病原實(shí)時熒光PCR檢測方法Real-timefluorescentPCRfordetectingofdistempervirusandother10viralpathogensofmink,foxandraccoondog2018-06-12發(fā)布2018-07-12實(shí)施山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局???發(fā)布DB37/T3319—2018前??言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—
2、2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：山東省動物疫病預(yù)防與控制中心、山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、威海市動物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王貴升、王金寶、田夫林、張鶴曉、崔凱、張?jiān)?、張華杰。6DB37/T3319—2018水貂、狐和貉犬瘟熱病毒等10種病毒性病原實(shí)時熒光PCR檢測方法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水貂、狐和貉犬瘟熱病毒等10種病毒性病原實(shí)時熒光PCR檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的實(shí)驗(yàn)室檢測方法適用于
3、水貂、狐和貉的犬瘟熱病毒、細(xì)小病毒、冠狀病毒、輪狀病毒、星狀病毒、阿留申病毒、杯狀病毒、博卡病毒、圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒等10種病毒的熒光PCR檢測方法，其他動物參考。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法3 縮略語熒光PCR實(shí)時熒光聚合酶鏈?zhǔn)?/p>
4、反應(yīng)Ct值每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號量達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)圈數(shù)DNA脫氧核糖核酸RNA核糖核酸Taq酶TaqDNA聚合酶PBS磷酸鹽緩沖生理鹽水4 試劑和材料4.1 熒光定量PCR檢測儀及配套反應(yīng)管（板）。4.2 高速臺式冷凍離心機(jī)（離心速度12000r/min以上）。4.3 混勻器。4.4 恒溫水浴鍋。4.5 冰箱（2℃～8℃和-20℃兩種）。4.6 微量移液器（0.5L～10L，5L～20L，20L～200L，200L～1000L）及配套吸頭。4.7 1.5mL離心管（無核酸酶）。4.8 D
5、NARNA核酸提取試劑等。5 樣品的采集與前處理6DB37/T3319—2018采樣過程中樣本不得交叉污染，采樣及樣品前處理過程中須戴一次性手套。1.1 取樣工具1.1.1 棉拭子、剪刀、鑷子、研缽、Eppendorf管。1.1.2 所有上述取樣工具必須經(jīng)（121±2）℃，15min高壓滅菌并烘干或經(jīng)160℃干烤2h。1.2 采樣方法1.2.1 拭子樣品a)咽喉拭子采樣，采樣時要將拭子深入喉頭及上腭來回刮3次～5次，取咽喉分泌液。然后將拭子插入到裝有1.0mLPBS無菌Eppendorf管中，編號
6、備用。b)肛拭子采樣，采樣時要將拭子深入肛門回刮3次～5次，取排泄物。然后將拭子插入到裝有1.0mLPBS無菌Eppendorf管中，編號備用。1.2.2 內(nèi)臟或肌肉樣品用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品1.0g于研缽中充分研磨，再加5.0mLPBS混勻，然后將組織懸液轉(zhuǎn)入無菌Eppendorf管中，編號備用。1.2.3 血清或血漿用無菌注射器直接吸取至無菌Eppendorf管中，編號備用。1.3 存放與運(yùn)送采集或處理的樣本在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；若需長期保存，須放置-70℃以下冰箱，但應(yīng)
7、避免反復(fù)凍融（最多凍融3次）。采集的樣品密封后，采用保溫設(shè)施加冰密封，盡快運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。2 引物及探針引物及探針見表1“熒光PCR方法的引物及探針”。表1 熒光PCR方法的引物及探針RNA病毒犬瘟熱病毒FGCAAGCGAGGATTGAGGGTATRGGCCTATGGGACACACTCAAAProbeFAM-CACCGACCATCCAGACGTTGCTCCT-BHQ星狀病毒FTCCAGGCATTTGAGTATGCCRCCACATAATCCTGGGGGAProbeFAM-CGGGAGTCGTGGGAC-
8、BHQ冠狀病毒FTGGGAC(T)TATCCT(A)AAG(A)TGTGARTAA(G)CACACAACNCCATCATCProbeFAM-CGGGAGTCGTGGGAC-BHQ杯狀病毒FCTGACTTCAAATTTCATCTCRTGGGAATTAAGTCAGAGGProbeFAM-ATCTATGCTCACTCATGGATCTGTC-BHQ輪狀病毒FTTTATAGATAATGTATGTATGGATGRCCAATTCTCAATGTAATCAGProbeFAM-AATAG
