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《水稻簡易RNAi載體構(gòu)建及沉默效果鑒定-論文.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、一!慧ONines搬髓熊鎦擒嫩獬／?裝ystem：http：／／ww茹w．jabiotech．org—帕■『■J_-_2o14,7：水稻簡易RNAi載體構(gòu)建及沉默效果鑒定劉燕霞彭廷趙亞帆杜彥修張靜李俊周孫紅正趙全志河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南省水稻工程實驗室，農(nóng)業(yè)部黃淮海作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州450002通訊作者，sunhongzheng@foxmail．com；qzzhaoh@126．com摘要RNA干擾(RNAi)技術(shù)是研究基因功能的一種常用方法，為了快捷高效地構(gòu)建水稻(簡易RNAi表達載體，本研究采用簡易RNAi構(gòu)建法，設(shè)計3’末端9個堿基互補的正向和反向寡
2、聚核苷酸引物，通過聚合酶延伸成為具有反向重復(fù)序列的小干擾片段。以pCAMBIA1301一Gtl3a為表達載體，將小干擾片段與表達載體經(jīng)過一次雙酶切與連接得到RNAi載體。用農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)法得到水稻(Oryzasativassp．japonica)轉(zhuǎn)基因株系后，用葉片GUS染色和qRT-PCR法，對RNAi轉(zhuǎn)基因水稻和野生型日本晴葉片GUS組織活性和籽粒中目的基因表達量進行檢測。水稻葉片GUS染色結(jié)果顯示，有10株轉(zhuǎn)基因水稻葉片切口處呈現(xiàn)藍色，而野生型無顯色反應(yīng)，說明RNAi載體T-DNA區(qū)域的基因己整合到水稻基因組上，并表達。在mRNA水平上轉(zhuǎn)基
3、因水稻籽粒中目的基因相對表達量降低至18％～55％，差異極顯著(P<0．01)，表明整合在水稻基因組上的小干擾片段能降低目的基因的表達水平。籽粒灌漿成熟后對10株轉(zhuǎn)基因水稻及野生型日本晴籽粒的單粒重、粒長、粒寬和厚度分別進行測量。與野生型日本晴相比，轉(zhuǎn)基因水稻籽粒單粒重發(fā)生顯著性降低(P<0．05)，籽粒變小，長和寬都發(fā)生顯著性變化(P<0．05)，說明簡易RNAi載體對水稻目的基因的表達起到很好的沉默效果。本研究不僅為利用簡易RNAi構(gòu)建法研究水稻功能提供了依據(jù)，也為快捷高效地研究水稻基因功能提供了基礎(chǔ)資料。關(guān)鍵詞水稻，RNAi載體構(gòu)建，沉默效果ConstructionofSimpleRNA
4、iVectorandIdentificationofSilencingEffectinRice(Oryzasativassp．japonica)LIUYan—XiaPENGTingZHA0、，a—FanDUYan—XiuZHANGJingLIJun—ZhouSUNHong—ZhengZHAOQuan—ZhiCollaborativeInnovationCenterofHenanGrainCrops，RiceEngineeringLaboratoryofHenan，KeylaboratoryofCropEcophysiologyandFarmingSysteminHuanghuaihaiRegi
5、on，HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002，ChinaCorrespondingauthor,sunhongzheng@foxmail．com；qzzhaoh@126tomAbstractRNA1nterference(RNAi)techniquehasbeenusedongenefunctionresearchfrequently．InordertoconstructakindofsimpleRNAiexpressionvectorwhichisadaptedtorice(Oryzasativassp．japonica)rapidlyande
6、ficiently,apairofforwardandreverseprimersOligOnucleOtideswith9bpofcomplementarynucleosidesat3’endwasdesigned，andasmallinterferingsegmentwithinvertedrepeatedsequenceoftargetgenebypolymeraseextendingwasformed，whichwasdigestedandligasedintothebasicexpressionvectorpCAMBIA1301toconstructRNAivectorwithani
7、nvertedrepeatedsequence．AfterAgribacteriumtumefacienstransformation，bothwildtypeandtransgeniclinesofricewerevalidatedbyleafGUSstainingandqRT-PCRoftargetgenesingrains．TheGUSstainingresultshowedthatthec
