新生大鼠海馬腦片培養(yǎng)方法

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1、中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志２００５年２月；１９（１）：７０－７４·７０·ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ２００５Ｆｅｂ；１９（１）：７０－７４新生大鼠海馬腦片培養(yǎng)方法王勇２，朱小南１，陳汝筑１，何進(jìn)１，余劍平１，汪雪蘭１（１．中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東廣州５１００８９；２．南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院臨床藥理基地，廣東廣州５１０２８２）摘要：目的建立新生大鼠海馬腦片體外長期培養(yǎng)了理想的條件。由于體外培養(yǎng)腦片突出的優(yōu)越性，方法。方法取出生后１０ｄ的新生大鼠海馬，切成因此腦片培養(yǎng)技術(shù)十分重要。隨著腦片培養(yǎng)技術(shù)的３００μｍ厚的腦片，轉(zhuǎn)至

2、帶有微孔膜插件的培養(yǎng)皿中不斷改進(jìn)，目前國外不僅建立了新生鼠海馬腦片培進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)期間進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并通過ＭＴＴ養(yǎng)技術(shù)，而且還探討了成年鼠海馬腦片的培養(yǎng)技法鑒定組織活力，免疫組化法觀察膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)損傷術(shù)［６］。但在培養(yǎng)海馬腦片長期成活的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)的反應(yīng)，電生理反應(yīng)以檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞功能。結(jié)果地觀察培養(yǎng)海馬腦片的生理功能尤其是神經(jīng)沖動(dòng)傳培養(yǎng)海馬腦片逐漸變薄，５ｄ后結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)輸?shù)难芯繄?bào)道目前還不多。本研究采用微孔膜插件完整；ＭＴＴ法顯示培養(yǎng)４０ｄ內(nèi)的海馬組織均能保持培養(yǎng)海馬腦片，并通過多種方法鑒定培養(yǎng)海馬腦片高攝入ＭＴＴ能力；在Ｓｃｈａｆ

3、ｆｅｒ側(cè)枝給予單脈沖刺激，的存活和功能。于ＣＡ１區(qū)能接收到完整的群峰電位；谷氨酸導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白高表達(dá)。結(jié)論本方法１材料與方法培養(yǎng)４０ｄ的海馬腦片具有正常的活力和功能。關(guān)鍵詞：海馬；海馬腦片，培養(yǎng)的；模型，動(dòng)物１．１動(dòng)物、試劑與儀器新生１０ｄ的Ｗｉｓｔａｒ乳大鼠由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中圖分類號(hào)：Ｒ９６５．２中心提供，ＭＥＭ培養(yǎng)基、馬血清購于ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司，文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ膜插件（ｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｓｅｒｔ）為Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司產(chǎn)品；噻唑藍(lán)文章編號(hào)：１０００３００２（２００５）０１００７００５（ＭＴＴ）、抗膠質(zhì)纖維

4、酸性蛋白（ｇｌｉａｌｆｉｂｒｉｌｌａｒｙａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）抗體、焦油紫均購于Ｓｉｇｍａ公司。對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)許多功能的研究，最理想的條件是體視顯微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＳＺＸＩＬＬＢ２００）、振動(dòng)切片保持在體固有的、立體的神經(jīng)細(xì)胞之間及神經(jīng)細(xì)胞機(jī)（ＭＡ７５２ｍｏｔｏｒｉｓｅｄａｄｖａｎｃｅｖｉｂｒｏｓｌｉｃｅ）、電位記錄系與非神經(jīng)細(xì)胞之間動(dòng)態(tài)聯(lián)系的基礎(chǔ)上進(jìn)行，這種在統(tǒng)（ＮｉｈｏｎＫｏｈｄｅｎ）、顯微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ４０ＰＤＨＪ１１）體細(xì)胞間固有的完整聯(lián)系通過神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)是不能和細(xì)胞培養(yǎng)箱（ＦｏｒｍａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ

5、３１１１）。實(shí)現(xiàn)的。但是，在體研究最大的困難在于實(shí)驗(yàn)受制１．２腦片培養(yǎng)約因素太多，不便控制實(shí)驗(yàn)條件和觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。［７］腦片制備參照Ａｄａｍｃｈｉｋ等方法。將出生后體外培養(yǎng)的腦片包含了與在體腦組織相同的細(xì)胞種１０ｄ的乳鼠用７５％乙醇浸泡消毒后，斷頭取腦，迅類及細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)，保存了正常完整的突觸速置于預(yù)冷的解剖緩沖液中，分離出完整的海馬。回路、受體分布、遞質(zhì)傳遞和其他生理功能［１］。腦片將海馬放置于振動(dòng)切片機(jī)的載物平臺(tái)上，在解剖緩的體外長期培養(yǎng)為研究藥物和毒物對(duì)中樞神經(jīng)的慢沖液中以３００厚度進(jìn)行切片。［２，３］［４］［５］μｍ性作用、神

6、經(jīng)損傷與修復(fù)、神經(jīng)發(fā)育等提供膜插件處理：在每一培養(yǎng)皿中放置一個(gè)膜孔為０．２２μｍ的膜插件，加入１ｍＬ含２５％馬血清的收稿日期：２００４０５１７接受日期：２００４１０２２ＭＥＭ培養(yǎng)液使培養(yǎng)插件膜潤濕至半透明，并于培養(yǎng)基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金（０４０２０４３０）腦片前１ｈ放入３７℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的作者簡介：王勇（１９６６－），男，重慶市人，醫(yī)學(xué)博士，副教授，主要從事藥理與毒理學(xué)、分子生物學(xué)研究。酸堿度。聯(lián)系作者Ｅｍａｉｌ：１９６６７３＠１６３．ｃｏｍＴｅｌ：（０２０）腦片孵育：經(jīng)過漂洗的每３～４塊海馬腦片被置６１６４３

7、５５５Ｆａｘ：（０２０）６１６４２９８３于同一膜插件上，在解剖鏡下使其分布均勻。腦片·７２·ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ２００５Ｆｅｂ；１９（１）Ｆｉｇ３．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｃｒｅｓｙｌｖｉｏｌｅｔｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｓｌｉｃｅｓｏｆｒａｔ．Ｔｈｅｓｅｃｔｉｏｎｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｍａｊｏｒｎｅｕｒｏｎａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ｎｏｒｍａｌｎｅｕｒｏｎｓｏｆｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｗｅｒｅｓｈｏｗｎｉｎｐｉｃｔｕｒｅ．２．３神經(jīng)元胞體形態(tài)表達(dá)明顯增加（圖５Ｂ）。對(duì)培養(yǎng)２０，４

8、０ｄ的海馬腦對(duì)培養(yǎng)１０～４０ｄ的海馬腦片進(jìn)行焦油紫染色，片進(jìn)行同樣的觀察，膠質(zhì)細(xì)胞的激活反應(yīng)未見減弱結(jié)果顯示：在４０ｄ培養(yǎng)期間，海馬腦片從ＣＡ１至（圖５Ｃ，Ｄ）。ＣＡ３及齒狀回都