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《亞洲玉米螟酚氧化酶原的原核表達和性質(zhì)分析-論文.pdf》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、昆蟲學(xué)報ActaEntomologicaSinica,July2014,57(7):798—805ISSN0454-6296亞洲玉米螟酚氧化酶原的原核表達和性質(zhì)分析趙同偉撐,張兵#,呂文靜。,翟會鋒。,吳桃燕,張石洋,湯小偉,馮從經(jīng)(1.揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院植物保護系,江蘇揚州225009;2.江蘇省大豐市農(nóng)業(yè)干部學(xué)校,江蘇鹽城224100;3.江蘇省泰州市出入境檢驗檢疫局,江蘇泰州225300)摘要:【目的】昆蟲體內(nèi)酚氧化酶原(PPO)是一種重要的天然免疫蛋白,參與昆蟲的體液免疫和細胞免疫過程。本研究采用原核表達體系,大量表達可溶且具有活
2、性的重組PPO蛋白,可用于各種酚氧化酶(PO)抑制劑的篩選,從而為創(chuàng)制抑制昆蟲免疫系統(tǒng)的新型殺蟲劑提供條件?!痉椒ā坷脧膩喼抻衩酌鳲striniafurnacalis5齡幼蟲體內(nèi)克隆獲得PPO基因,構(gòu)建了pET一28b.PPO原核表達載體,在大腸桿菌Escherichiacoli中重組表達了亞洲玉米螟PPO蛋白;采用Ni—NAT親和層析柱快速純化目的蛋白,進行了Western雜交鑒定;測定分析了重組PPO蛋白激活為PO后的酶學(xué)性質(zhì)以及不同金屬離子(Mg“,cu和Fe)對PPO二級結(jié)構(gòu)的影響?!窘Y(jié)果】融合蛋白PPO得到了表達和純化。重組PPO蛋白
3、激活為PO后最適反應(yīng)溫度為3O℃,最適pH為7.2,以L—DOPA為底物時PO催化反應(yīng)的為140.8U/mg·min,Km為2.96mmol/L。Fe存在的情況下重組PPO蛋白中B一折疊結(jié)構(gòu)成分顯著增加至53.7%±4.6%,僅一螺旋結(jié)構(gòu)成分則顯著下降至2.6%4-1.2%(P<0.05);有Mg存在的情況下,重組PPO蛋白中B-折疊結(jié)構(gòu)成分顯著下降,ot一螺旋結(jié)構(gòu)成分稍有上升。有cu“存在的情況下,重組PPO蛋白中B一折疊結(jié)構(gòu)成分顯著下降為10.0%±1.6%,而ot.螺旋結(jié)構(gòu)成分則上升至35.3%±6.9%?!窘Y(jié)論】結(jié)果說明不同金屬離子對重組
4、PPO蛋白的二級結(jié)構(gòu)有顯著影響。關(guān)鍵詞:亞洲玉米螟;酚氧化酶原;原核表達;蛋白純化;酚氧化酶;酶學(xué)性質(zhì)中圖分類號:Q966文獻標(biāo)識碼:A文章編號:0454-6296(2014)07-0798-08Prokaryoticexpressionandcharacterization0fpr0phenOl0xidasefromtheAsiancornborer.Ostriniafurnacalis(Lepidoptera:Pyralidae)ZHAoTong—Wei,ZHANGBinglj,LOWen.Jing,ZHAIHui.Feng,WUTao—Ya
5、n,ZHANGShi—Yang。TANGXiao—Wei。FENGCong.Jing(1.DepartmentofPlantProtection,CollegeofHorticultureandPlantProtection,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu225009,China;2.DafengSchoolofAgriculturalCadres,Yancheng,Jiangsu224100,China;3.TaizhouEntry—ExitInspectionandQuarantineBureau,Ta
6、izhou,Jiangsu225300,China)Abstract:【Aim】Prophenoloxidase(PP0)isanimportantimmuneproteinininsects,whichisinvolvedininsecthumoralimmunityandcellularimmunity.Inourstudy,theprokaryoticexpressionsystemwasappliedtoexpresssolublerecombinantPPOwithactivityonalargescale.Therecombinant
7、PPOwasusedtoscreenvariousphenoloxidase(PO)inhibitorssoastocreatenovelinsecticidestargetedontheinsectimmunesystem.【Methods】UsingthePPOgeneclonedfromthe5thinstarlarvaeoftheAsiancornborer,Ostriniafurnacalis(Guen6e),theprokaryoticexpressionvector,pET-28b—PPO,wasconstructed,andthe
8、recombinantPPOproteinwasexpressedinEscherichiacoli.Thefusionproteinw