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《亞洲玉米螟酚氧化酶原的原核表達和性質(zhì)分析-論文.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、昆蟲學(xué)報ActaEntomologicaSinica，July2014，57(7)：798—805ISSN0454-6296亞洲玉米螟酚氧化酶原的原核表達和性質(zhì)分析趙同偉撐，張兵#，呂文靜。，翟會鋒。，吳桃燕，張石洋，湯小偉，馮從經(jīng)(1．揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院植物保護系，江蘇揚州225009；2．江蘇省大豐市農(nóng)業(yè)干部學(xué)校，江蘇鹽城224100；3．江蘇省泰州市出入境檢驗檢疫局，江蘇泰州225300)摘要：【目的】昆蟲體內(nèi)酚氧化酶原(PPO)是一種重要的天然免疫蛋白，參與昆蟲的體液免疫和細胞免疫過程。本研究采用原核表達體系，大量表達可溶且具有活
2、性的重組PPO蛋白，可用于各種酚氧化酶(PO)抑制劑的篩選，從而為創(chuàng)制抑制昆蟲免疫系統(tǒng)的新型殺蟲劑提供條件?！痉椒ā坷脧膩喼抻衩酌鳲striniafurnacalis5齡幼蟲體內(nèi)克隆獲得PPO基因，構(gòu)建了pET一28b．PPO原核表達載體，在大腸桿菌Escherichiacoli中重組表達了亞洲玉米螟PPO蛋白；采用Ni—NAT親和層析柱快速純化目的蛋白，進行了Western雜交鑒定；測定分析了重組PPO蛋白激活為PO后的酶學(xué)性質(zhì)以及不同金屬離子(Mg“，cu和Fe)對PPO二級結(jié)構(gòu)的影響?！窘Y(jié)果】融合蛋白PPO得到了表達和純化。重組PPO蛋白
3、激活為PO后最適反應(yīng)溫度為3O℃，最適pH為7．2，以L—DOPA為底物時PO催化反應(yīng)的為140．8U／mg·min，Km為2．96mmol／L。Fe存在的情況下重組PPO蛋白中B一折疊結(jié)構(gòu)成分顯著增加至53．7％±4．6％，僅一螺旋結(jié)構(gòu)成分則顯著下降至2．6％4-1．2％(P<0．05)；有Mg存在的情況下，重組PPO蛋白中B-折疊結(jié)構(gòu)成分顯著下降，ot一螺旋結(jié)構(gòu)成分稍有上升。有cu“存在的情況下，重組PPO蛋白中B一折疊結(jié)構(gòu)成分顯著下降為10．0％±1．6％，而ot．螺旋結(jié)構(gòu)成分則上升至35．3％±6．9％?！窘Y(jié)論】結(jié)果說明不同金屬離子對重組
4、PPO蛋白的二級結(jié)構(gòu)有顯著影響。關(guān)鍵詞：亞洲玉米螟；酚氧化酶原；原核表達；蛋白純化；酚氧化酶；酶學(xué)性質(zhì)中圖分類號：Q966文獻標(biāo)識碼：A文章編號：0454-6296(2014)07-0798-08Prokaryoticexpressionandcharacterization0fpr0phenOl0xidasefromtheAsiancornborer．Ostriniafurnacalis(Lepidoptera：Pyralidae)ZHAoTong—Wei，ZHANGBinglj，LOWen．Jing，ZHAIHui．Feng，WUTao—Ya
5、n，ZHANGShi—Yang。TANGXiao—Wei。FENGCong．Jing(1．DepartmentofPlantProtection，CollegeofHorticultureandPlantProtection，YangzhouUniversity，Yangzhou，Jiangsu225009，China；2．DafengSchoolofAgriculturalCadres，Yancheng，Jiangsu224100，China；3．TaizhouEntry—ExitInspectionandQuarantineBureau，Ta
6、izhou，Jiangsu225300，China)Abstract：【Aim】Prophenoloxidase(PP0)isanimportantimmuneproteinininsects，whichisinvolvedininsecthumoralimmunityandcellularimmunity．Inourstudy，theprokaryoticexpressionsystemwasappliedtoexpresssolublerecombinantPPOwithactivityonalargescale．Therecombinant
7、PPOwasusedtoscreenvariousphenoloxidase(PO)inhibitorssoastocreatenovelinsecticidestargetedontheinsectimmunesystem．【Methods】UsingthePPOgeneclonedfromthe5thinstarlarvaeoftheAsiancornborer，Ostriniafurnacalis(Guen6e)，theprokaryoticexpressionvector，pET-28b—PPO，wasconstructed，andthe
8、recombinantPPOproteinwasexpressedinEscherichiacoli．Thefusionproteinw
