酶活力的測定--國標(biāo).doc

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1、木瓜蛋白酶活力的測定一、試劑與溶液1.三氯乙酸稱取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。2.L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（100μg/mL）精確稱取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L鹽酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即為1mg/mL酪氨酸溶液。吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L鹽酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。3.氫氧化鈉溶液（20g/L）稱取氫氧化鈉2g，加水?dāng)嚢枞芙?。待溶液到室溫后，以水定容?00mL，攪拌均勻。4.鹽酸溶液1mol/L:取22.5ml的濃鹽酸溶液，加水定容至250ml。0.1mol/

2、L：取1.8ml的濃鹽酸溶液，加水定容至200ml。5.酪蛋白溶液（10.0g/L）稱取標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白1g，用少量氫氧化鈉溶液潤濕，加入相應(yīng)的緩沖溶液約80mL，在沸水浴中100℃加熱回流30min。冷卻到室溫后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用適宜的pH緩沖溶液稀釋至刻度。此溶液在冰箱內(nèi)貯存，有效期為3d。使用前重新確認(rèn)并調(diào)整pH至規(guī)定值。二、分析步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：按表1配制。L-酪氨酸稀釋液應(yīng)在稀釋后立即進(jìn)行測定。表1L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液管號酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（μg/mL）酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液體積（mL）加水體積（mL）000101101922028330374404655055分

3、別取上述所配的溶液，以0管為空白，利用紫外分光光度計于波長275nm下測定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用回歸方程，計算出吸光度為1時的酪氨酸的量（μg），即為吸光常數(shù)K值。其K值應(yīng)在130~135范圍內(nèi)，如不符合，需重新配制試劑，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.樣品的測定待測酶液的制備：稱取酶樣品1g。然后用磷酸緩沖溶液充分溶解，定容至50ml。測定：先將酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒溫水浴中，預(yù)熱5min，然后按以下流程操作：試管A（空白）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加三氯乙酸4.00mL（搖勻）↓（40±0.2）℃，10min加酪蛋白溶

4、液2.00mL（搖勻）↓取出靜止10min，過濾（慢速定性濾紙）定容至100ml↓測濾液吸光度試管B（酶試樣，需三個平行樣）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加酪蛋白溶液2.00mL（搖勻）↓（40±0.2）℃，10min加三氯乙酸4.00mL（搖勻）↓取出靜止10min，過濾（慢速定性濾紙）定容至100ml↓測濾液吸光度三、計算過程從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品最終稀釋液的酶活力，單位為u/mL。樣品的酶活力按下式計算：X2=(X1×V×n×8)/(2×m×10)式（1）式（1）中：X1—由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的樣品最終稀釋液的酶活力，u/mL；X2—樣品的酶活力，u/g；V—溶解樣品所

5、使用量瓶的體積，mL；n—稀釋倍數(shù)；8—反應(yīng)試劑的總體積，mL；2—吸取酶液的體積，mL；m—樣品的質(zhì)量，g；1/10—反應(yīng)時間10min，以1min計。1、標(biāo)線的繪制管號酪氨酸的濃度（μg/mL）吸光度A峰所在的波長λ(nm)1100.08502742200.15042743300.23297244400.30112745500.3785274∵吸光度A=1時的酪氨酸的量（μg），即為吸光常數(shù)K值∴求得K=134.01352、樣品的測定管號吸光度A峰所在的波長λ由標(biāo)線所得濃度C（μg/mL）空白沒有峰平行10.216027328.07平行20.216027328.07