酶活力的測(cè)定

《酶活力的測(cè)定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。

1、實(shí)驗(yàn)26過(guò)氧化氫酶活力的測(cè)定（必修）[目的與原理]掌握過(guò)氧化氫酶活力的測(cè)定原理和比色測(cè)定方法，并用此方法測(cè)定水產(chǎn)動(dòng)物血清中過(guò)氧化氫酶的活力。血清中的過(guò)氧化氫酶（CAT）分解H2O2的反應(yīng)，可通過(guò)加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，在405nm處測(cè)定其生成量，即可計(jì)算出CAT的活力，CAT活力單位定義為：每1分鐘分解1μmol的過(guò)氧化氫即為1個(gè)酶活力單位（U）。[試劑與器材]試劑：1、磷酸鹽緩沖液（67mmol/l，pH=7.4）：取Na2HP047.60g，KH2P041.82g，溶于1L蒸餾水中，調(diào)pH至7.

2、4。2、基質(zhì)液（65μmol/l,H2O2）：取30%H2O23.69ml加pH7.4磷酸鹽緩沖液至500ml。3、鉬酸銨：稱?。?NH4)6Mo7O24］20.2g溶于500ml蒸餾水中。器材：721分光光度計(jì),0.5cm比色杯，恒溫水箱（37℃±0.5℃），試管16mm×100mm，移液管，吸耳球，可調(diào)微量進(jìn)樣器。[實(shí)驗(yàn)步驟]1、樣品測(cè)定：基質(zhì)液置于37℃水浴5min，然后按下列步驟操作試劑對(duì)照管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管基質(zhì)液1.0ml1.0ml1.0ml鉬酸銨1.0ml1.0ml—緩沖液—0.2ml—血清0.2ml—0.2ml37℃水浴準(zhǔn)確溫育60

3、s后，立即加入鉬酸銨1.0ml搖勻，10min后于405nm以蒸餾水調(diào)零比色。記錄各管吸光度值（A）2、計(jì)算：過(guò)氧化氫酶活力(U/L)=[(A對(duì)－A測(cè))/A標(biāo)]×（65×1×1000/0.2×1000）=[(A對(duì)－A測(cè))/A標(biāo)]×325(式中65為標(biāo)準(zhǔn)管H2O2濃度，1為1.0mlH2O2體積，1000換算成1L血清，0.2為血清用量，1000為μmol換算成mmol)[方法評(píng)估]本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法測(cè)定底物（H2O2）的減少量來(lái)評(píng)價(jià)過(guò)氧化氫酶活力。此法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間（1小時(shí)）內(nèi)顯色穩(wěn)定，適于科研和實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)用。[應(yīng)用意義]CAT具

4、有重要的生理功能，細(xì)胞內(nèi)與產(chǎn)生H2O2的需氧脫氫酶類（如氨基酸氧化酶等）同時(shí)存在，能將細(xì)胞代謝所產(chǎn)生的毒性物質(zhì)H2O2迅速加以清除，從而共同保護(hù)血紅蛋白、巰基酶、膜蛋白和解毒作用。此外，CAT清除H2O2后可減少過(guò)氧化脂質(zhì)生成和對(duì)人體的毒害，因而有抗衰老和保護(hù)作用。[注意事項(xiàng)]1、反應(yīng)時(shí)間在80秒內(nèi)吸光度降低與反應(yīng)時(shí)間成反比關(guān)系，故選用60秒為測(cè)定時(shí)間（所以本法不宜大批量樣品同時(shí)測(cè)定，以每批4～5份為宜）。2、酶活力在100~140U范圍內(nèi)呈線性關(guān)系；鉬酸銨和H2O2呈色反應(yīng)在pH＜7時(shí)吸光度升高，當(dāng)pH＞7.6時(shí)吸光度下降，故選用pH7.4

5、作為測(cè)定條件。3、黃色復(fù)合物至少在1h內(nèi)穩(wěn)定。4、血清不能溶血，溶血樣品應(yīng)該棄去。5、加入鉬酸銨后，由于釋放O2，氣泡會(huì)干擾比色，宜在顯色10min后比色。[思考題]1、試述過(guò)氧化氫酶的測(cè)定方法？2、底物與血液中過(guò)氧化氫酶反應(yīng)時(shí)間為什么要準(zhǔn)確定為60秒？3、試述過(guò)氧化氫酶催化H2O2反應(yīng)的機(jī)制？淀粉酶活力的測(cè)定（必修）[目的與原理]掌握淀粉酶活力的測(cè)定方法，測(cè)定水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的主要消化器官肝胰臟、胃、腸內(nèi)的淀粉酶活力。淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷鍵水解，產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖等。在基質(zhì)充分的條件下，反應(yīng)后加入的碘液與未被水解的淀粉結(jié)合成藍(lán)色復(fù)合物，

6、其藍(lán)色深淺與未經(jīng)酶促反應(yīng)的空白管比較其吸光度，從而推算出淀粉酶的活力單位。[試劑與器材]試劑：1、0.04%可溶性淀粉精確稱取可溶性淀粉0.20g，置于20ml燒杯內(nèi)，加入蒸餾水約5ml，搖勻使成淀粉混懸液，另稱取無(wú)水磷酸二氫鈉13.3g及苯甲酸4.3g，共置于500ml燒杯內(nèi)，加入蒸餾水約250ml,煮沸后，將淀粉混懸液倒入此燒杯內(nèi)，并用蒸餾水洗滌裝淀粉混懸液的燒杯數(shù)次，洗滌亦倒入此燒杯內(nèi)。繼續(xù)煮沸1分鐘，冷卻至室溫后倒入500ml容量瓶中，并用蒸餾水稀釋至500ml刻度。此淀粉液pH應(yīng)為7.0±0.1，在室溫下保存2―3個(gè)月。2、0.1N

7、碘貯存液：精確稱取碘酸鉀(KIO3)3.567g及碘化鉀（KI）45g置于1L容量瓶?jī)?nèi)，加入蒸餾水約800ml，然后緩慢加入濃鹽酸9ml，搖勻后用蒸餾水稀釋至1L刻度，置冰箱內(nèi)備用。3、0.01N碘應(yīng)用液：取0.1N碘貯存液50ml，用蒸餾水稀釋至500ml，盛于棕色瓶中置冰箱內(nèi)約保存1個(gè)月。材料：新鮮魚(yú)、蝦、貝的肝胰臟、胃、腸標(biāo)本。器材：分光光度計(jì)、電子天平、離心機(jī)、pH測(cè)定儀，恒溫水箱、勻漿器、剪子、鑷子、冰塊、50ml比色管若干、移液管若干，500ml容量瓶，燒杯。[實(shí)驗(yàn)步驟]1、酶提取液的制備取新鮮肝胰臟、胃、腸組織稱重，在冰盤(pán)上剔除

8、脂肪及內(nèi)容物，以10倍緩沖液或去離子水勻漿各組織，將組織懸液低溫下離心（3000rpm/min）,上清液為酶粗提液（酶液）。2、（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)蛋白酶活力的測(cè)定）2、淀粉酶