影響畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的因素.doc

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1、影響畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的因素?zé)熡昴獑栒?巴斯德畢赤酵母(Pichiapatoris)表達(dá)系統(tǒng)是目前最優(yōu)秀、應(yīng)用最廣泛的外源基因表達(dá)系統(tǒng)之一。它不但克服了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)不能表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)、表達(dá)的蛋白多形成包涵體、背景蛋白多、表達(dá)量不很高等缺陷；彌補(bǔ)了哺乳類細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)操作復(fù)雜，表達(dá)水平低，生產(chǎn)造價(jià)昂貴的不足，還具有其它酵母表達(dá)系統(tǒng)無法比擬的優(yōu)越之處。但是酵母為高好氧微生物，在發(fā)酵過程中常常會(huì)出現(xiàn)供氧不足而限制了細(xì)胞密度的情況。關(guān)鍵詞:畢赤酵母分泌表達(dá)微生物載體構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)一、重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)比較隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，大量重組蛋白得到了有效

2、地外源表達(dá)。目前主要的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)有:大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等表達(dá)體系[1]。相比之下(表1)，各種表達(dá)系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn):表1各種表達(dá)體系特征比較表達(dá)體系優(yōu)缺點(diǎn)產(chǎn)量原核體系大腸桿菌具有良好的可操作性,成本低,但不能進(jìn)行糖基化修飾,胞內(nèi)形成包涵體外源蛋白10%～70%胞內(nèi)表達(dá),0.3%～4%胞外表達(dá)真核體系酵母兼具原核細(xì)胞良好的可操作性和真核系統(tǒng)的后加工能力,但存在產(chǎn)量低及過度糖基化等問題外源蛋白約占菌體總蛋白的10%甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母第二代酵母表達(dá)系統(tǒng),部分克服了過度糖基化缺點(diǎn),有較好分泌性,產(chǎn)量較高,但產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與天然分子仍有一些差異。外源蛋

3、白占菌體總蛋白的10～30%昆蟲細(xì)胞具有高等真核生物表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn),產(chǎn)物的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白質(zhì)相似,表達(dá)水平較高,但糖基化程度較低,形式單一。外源蛋白占菌體總蛋白的1～500mg/L哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)物的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白質(zhì)最接近,糖基化等后加工最準(zhǔn)確,但表達(dá)水平較低。發(fā)酵液中表達(dá)產(chǎn)物含量為0.2～200mg/L使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得表達(dá)產(chǎn)物，且所需的成本相對(duì)較低；但目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，產(chǎn)物純化困難，且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低[2]。酵母和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)水平

4、高，成本低，但翻譯后加工修飾體系與哺乳動(dòng)物不完全相同。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更接近于天然狀態(tài)，但表達(dá)量低，操作繁瑣，而且成本非常昂貴[3]。由于不同的表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)量、蛋白表達(dá)周期、蛋白折疊和加工能力、蛋白翻譯后修飾如糖基化修飾和經(jīng)濟(jì)成本等方面存在差異，因此需要根據(jù)不同的重組蛋白特點(diǎn)以及不同應(yīng)用目的來選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。二、酵母表達(dá)系統(tǒng)2.1畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)概述現(xiàn)在已經(jīng)建立和發(fā)展了多種酵母表達(dá)菌株，這些酵母各有特點(diǎn)，自1981年Hitzeman等用成功地表達(dá)了人干擾素以來，S.c表達(dá)了大量的外源蛋白，目前仍在在制藥業(yè)中廣泛應(yīng)用。但具有一定的局限性，如

5、難于高密度培養(yǎng)，缺乏強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，分泌效率低，很難分泌分子量大于30kDa的外源蛋白質(zhì)，而且富含甘露糖型的超高糖基化，表達(dá)蛋白質(zhì)的C末端經(jīng)常被截短[3]。人們?cè)谘芯窟^程中發(fā)現(xiàn)一種更好的表達(dá)系統(tǒng)——畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，目前該表達(dá)系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用，此系統(tǒng)不僅具有高穩(wěn)定、高表達(dá)、高分泌的特點(diǎn)，而且其宿主甲醇酵母一巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris)具有高密度生長(zhǎng)的特性。甲醇酵母是可利用甲醇作為單一C源的酵母，主要有H.Polymorpha、CandidaBodinii、PichiaPastoris三種。其中P.Pastoris作為基因表達(dá)系統(tǒng)使用得最多、

6、最廣泛，己被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的工具之一。作為一種新的高效的表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母越來越收到人們的重視。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已基本成為非常完善的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，具有易于高密度發(fā)酵，能使產(chǎn)物有效分泌并適當(dāng)糖基化，培養(yǎng)方便經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。利用強(qiáng)效可調(diào)控啟動(dòng)子A0X1，已高效表達(dá)了多種外源基因，證實(shí)該系統(tǒng)為高效、實(shí)用、簡(jiǎn)便，以提高表達(dá)量并保持產(chǎn)物生物學(xué)活性為突出特征的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，而且非常適宜子擴(kuò)大為工業(yè)規(guī)模。2009年來自該系統(tǒng)的KALBITOR已獲得FDA批準(zhǔn)，所以該系統(tǒng)被認(rèn)為是安全的。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在生物工程領(lǐng)域?qū)l(fā)揮越來越重要作用，促進(jìn)更多外源

7、基因在該系統(tǒng)的高效表達(dá)，提供更為廣泛的基因工程產(chǎn)品。2.2畢赤酵母的優(yōu)勢(shì)畢赤酵母系統(tǒng)的成功應(yīng)用，緣于該系統(tǒng)除了具有一般酵母所具有的特點(diǎn)外，還有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):(1)含有AOX啟動(dòng)子，這是目前啟動(dòng)能力最強(qiáng)，調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動(dòng)子之一，用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)；(2)表達(dá)量高，既可以胞內(nèi)表達(dá)，又可以分泌表達(dá)。絕大多數(shù)外源基因比在原核細(xì)胞、釀酒酵母、真核細(xì)胞中表達(dá)量高。一般畢赤酵母中外源基因都帶有分泌信號(hào)肽，使外源目的蛋白分泌到培養(yǎng)液中，方便純化；(3)發(fā)酵工藝成熟，適合高密度發(fā)酵。己經(jīng)有大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的發(fā)酵工藝，且細(xì)胞干重達(dá)150g/L以上[10

8、]，表達(dá)重組蛋白時(shí)，已成功放大到80，000升；(4)使用基礎(chǔ)鹽培