枯草芽孢桿菌的研究進(jìn)展.doc

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1、枯草芽孢桿菌的研究進(jìn)展摘要枯草芽孢桿菌是一類好氧型、內(nèi)生抗逆孢子的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，廣泛存在于土壤、湖泊、海洋、動(dòng)植物的體表，細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，沒(méi)有致病性，具有單層細(xì)胞外膜，能直接將許多蛋白分泌到培養(yǎng)基中，是一些重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌[1]。在營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下，枯草芽孢桿菌停止生長(zhǎng)，但同時(shí)加快代謝作用，產(chǎn)生多種大分子的水解酶和抗生素，并誘導(dǎo)自身的能動(dòng)性和趨化性，從而恢復(fù)生長(zhǎng)。在極端的條件下，還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗逆性很強(qiáng)的內(nèi)源孢子，具有較強(qiáng)的抗逆性。作為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的典型代表，對(duì)于其生理、生化、遺傳

2、及分子生物學(xué)的研究已有40多年的歷史。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基因工程的發(fā)展，枯草芽孢桿菌作為基因工程表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展迅速，并展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；啟動(dòng)子；綠色熒光蛋白；載體；表達(dá)；異源基因1枯草芽孢桿菌基因組研究枯草桿菌有以下一些優(yōu)點(diǎn):①非致病性，不具有熱源性脂多糖和細(xì)胞內(nèi)毒素，具有較好的生物安全性，炭疽桿菌和蠟樣芽孢桿菌除外，多數(shù)芽孢桿菌對(duì)人畜無(wú)害[2]；②遺傳學(xué)特性先進(jìn)，很多噬菌體和質(zhì)粒適合于用作克隆載體；轉(zhuǎn)化外源DNA的感受態(tài)系統(tǒng)也同樣適用于轉(zhuǎn)化重組DNA[3]。③較強(qiáng)的

3、蛋白分泌能力，當(dāng)分泌蛋白跨過(guò)細(xì)胞膜后，被加工和直接釋放到培養(yǎng)基中，使回收和純化目的蛋白較為簡(jiǎn)單[4]。④良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)?？莶輻U菌在工業(yè)上長(zhǎng)期被用于生產(chǎn)蛋白酶、α-淀粉酶以及蘇云金桿菌的殺蟲晶體蛋白等。枯草桿菌能在相對(duì)簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)到很高的密度。細(xì)胞的生長(zhǎng)特性和生理學(xué)性質(zhì)都被廣泛、深入研究。⑤細(xì)胞壁的組成簡(jiǎn)單，只含有肽聚糖和磷壁質(zhì)，因此在分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)品中不會(huì)混雜有胞被內(nèi)毒素（熱源性脂多糖），而這一點(diǎn)是大腸桿菌無(wú)法比擬的。2枯草芽孢桿菌基因表達(dá)特性2.1多σ因子原核基因的轉(zhuǎn)錄主要由R

4、NA聚合酶完成。該酶由5個(gè)亞基組成，二個(gè)α亞基、一個(gè)β亞基、一個(gè)β′亞基和一個(gè)Sigma（σ）因子。5個(gè)亞基組成全酶，除去σ因子為核心酶（E）。σ因子的主要功能是幫助核心酶識(shí)別特定的啟動(dòng)子而結(jié)合到轉(zhuǎn)錄的起始部位，轉(zhuǎn)錄開始后σ因子就不起作用了［5］。52.2啟動(dòng)子的特征迄今發(fā)現(xiàn)枯草桿菌啟動(dòng)子主要有兩種方式：一是單個(gè)啟動(dòng)子，具有單個(gè)啟動(dòng)子的基因，大多數(shù)在快速生長(zhǎng)時(shí)期表達(dá)；另一為復(fù)合啟動(dòng)子，它包括串聯(lián)啟動(dòng)子和重疊啟動(dòng)子。有如下特征：①不同類型的兩個(gè)啟動(dòng)子重疊；②兩個(gè)啟動(dòng)子有不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)或相同的起始

5、位點(diǎn)；③啟動(dòng)子可能受時(shí)序調(diào)節(jié)。這類啟動(dòng)子在枯草桿菌感知外界環(huán)境的變化、時(shí)序調(diào)節(jié)、孢子形成和萌發(fā)等諸多生命現(xiàn)象中發(fā)揮重要作用[6]。2.3終止子在大腸桿菌中根據(jù)轉(zhuǎn)錄終止是否依賴Rho蛋白因子而分為兩類，而在芽孢桿菌基因轉(zhuǎn)錄的終止方面，只有少數(shù)幾個(gè)基因如spoOA、gnt和trp操縱子等得到很好的研究[7]。它們的終止區(qū)都有一個(gè)富含GC的對(duì)稱序列，基因轉(zhuǎn)錄是在一串T堿基前終止的。有證據(jù)表明，枯草桿菌使用的終止子在結(jié)構(gòu)和序列特征上與大腸桿菌相似。而且也發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在枯草桿菌中同樣起作用。2.4芽孢桿菌m

6、RNA的核糖體連接位點(diǎn)(RBS)與其他原核生物一樣，枯草桿菌的RBS也涉及到SD序列、SD序列與起始密碼間的間隔區(qū)以及起始密碼子。芽孢桿菌中最常見的典型序列是“GGAGG”，而大腸桿菌的為“AAGGA”。在芽孢桿菌中，多數(shù)基因的起始密碼子為AUG，但也發(fā)現(xiàn)有些基因中是GUG。目前，尚不十分清楚不同起始密碼子的應(yīng)用對(duì)翻譯效率有什么影響［8］。2.5蛋白的外分泌大腸桿菌分泌蛋白往往分泌到兩層細(xì)胞膜之間，而芽孢桿菌只有一層細(xì)胞膜，因而可以大量分泌蛋白至培養(yǎng)基中。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析，枯草桿菌有將近300個(gè)N端

7、具有信號(hào)肽用來(lái)跨膜的蛋白。不過(guò)用來(lái)表達(dá)和分泌克隆基因的信號(hào)肽主要來(lái)自蛋白酶、淀粉酶和細(xì)胞壁表層蛋白等。3枯草芽孢桿菌的重組表達(dá)載體目前報(bào)道用作宿主表達(dá)克隆基因的有：枯草芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、耐堿的芽孢桿菌、病原菌炭疽芽孢桿菌，以及獨(dú)立與芽孢桿菌的短短芽孢桿菌［9］。選擇不同的芽孢桿菌作宿主，一般都有著極強(qiáng)的應(yīng)用研究的目的。53.1質(zhì)粒載體在枯草芽孢桿菌中，早期質(zhì)粒載體主要來(lái)自其他革

8、蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，特別是來(lái)自金黃色葡萄球菌的質(zhì)粒，其中使用廣泛的有Pub110、Pc164、pE194等[10]。它們的主要優(yōu)點(diǎn)在于分子量小，有唯一的酶切位點(diǎn)，較高的拷貝數(shù)，適合篩選的抗性標(biāo)記。3.2噬菌體不少噬菌體可用作芽孢桿菌的表達(dá)載體，如Φ105噬菌體、sppl噬菌體等，其中Φ105噬菌體應(yīng)用較多，其基因組約為39.2kb，利用鳥槍法（shotgunexperiment）可方便地分離感興趣的DNA片段。3.3染色體整合載體采用整合質(zhì)粒將克隆基因整合到宿主染色體，是克服芽孢桿菌質(zhì)粒