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1、迪康金諾NGS應(yīng)用交流會宏基因組研究在腸道微生物中的最新研究應(yīng)用報告人：樊玉才2014.06組織單位：江蘇省水產(chǎn)動物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室南京迪康金諾生物技術(shù)有限公司1大綱什么是宏基因組研究宏基因組研究的分析流程宏基因組研究的相關(guān)應(yīng)用2什么是宏基因組研究？無需培養(yǎng)，直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA,結(jié)合高通量測序來研究樣品中的微生物組成及群落功能。3宏基因組研究熱點(diǎn)MetaHIT?MetagenomicsofHumanIntestinalTract?人類腸道宏基因組計(jì)劃?HMP?HumanMicrobi
2、omeProject?人類微生物組計(jì)劃?GOS?GlobalOceanSamplingexpedition?全球海洋調(diào)查?EMP?EarthMicrobiomeProject?地球微生物計(jì)劃4宏基因組研究的分析流程提取環(huán)境樣本DNA獲取測序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析5提取環(huán)境樣本DNA宏基因組測序:?濃度≥50ng/ul;PowerWater?DNAIsolationKit?OD260/280:1.8-2.0;?DNA兩次需要量:≥3ugPowerSoil?DNAIsolationKitPowerFecal?
3、DNAIsolationKit6生物信息分析（一）數(shù)據(jù)質(zhì)控對測序數(shù)據(jù)的客觀評價數(shù)據(jù)質(zhì)量GC含量1)去除接頭污染和低質(zhì)量數(shù)據(jù)2)去除宿主污染7生物信息分析（二）：物種組成(16S/18S/ITS)121:物種豐度2:樣本聚類8生物信息分析（二）：物種組成(16S/18S/ITS)多樣性曲線PcoA分析9生物信息分析（三）基因功能分析代謝通路分析10生物信息分析（三）基因功能分析COG注釋CAzyme注釋11生物信息分析（四）個性化分析1)篩選與樣品分組顯著相關(guān)因子(基因、功能)2)基于篩選因子對樣品進(jìn)行
4、主成分分析(PCA)3)基于篩選因子對樣品進(jìn)行聚類分析（組數(shù)≥2,每組樣品數(shù)≥10)12大綱什么是宏基因組研究宏基因組研究的分析流程宏基因組研究的相關(guān)應(yīng)用13研究案例（一）Science：牛胃中微生物酶可用于開發(fā)生物燃料背景：纖維素是自然界中最豐富的碳水化合物資源。牛在反芻過程中涉及到纖維素的分解，研究牛的消化機(jī)制，有利于尋找應(yīng)用于生產(chǎn)生物燃料的酶。14研究思路瘺管奶牛將柳枝稷樣品置于牛的瘤胃中培養(yǎng)72小時，然后對附著在柳枝稷樣品上的所有微生物進(jìn)行基因組分析。IlluminaGAIIx＋I(xiàn)llumin
5、aHiSeq2000測序建庫：200,300,3k,5k雙端測序：2*125、2*200、2*7515研究結(jié)果總共識別了27,755與碳水化合水物綁定模塊或具有催化功能的候選基因16后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取233個候選基因，通過設(shè)計(jì)特定引物，然后使用PCR擴(kuò)增，其中158of233(68%)得到了擴(kuò)增產(chǎn)物。隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物通過載體（選擇90個候選基因）導(dǎo)入大腸桿菌，然后由這些細(xì)菌產(chǎn)生了90種蛋白質(zhì)酶，其中51of90(57%)具有酶活性17研究案例（二）：宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組背景：反芻動物排放的CH4是溫室氣體的重要
6、來源之一羊排放的甲烷氣體量存在差異性應(yīng)用宏基因組與宏轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)兩18組之間是否存在差異性研究思路樣本收集：4highest,4lowest,and2intermediateCH4yieldstwoseparatetimes(20samplestotal)高通量測序：SSUrRNAgenesequencing：454pyrosequencing測序：IlluminaHiSeq2000insertsizeof250bp、8kb2×150bppair-end19研究結(jié)果應(yīng)用宏基因組分析，沒有發(fā)現(xiàn)物種差異
7、性20宏基因組vs宏轉(zhuǎn)錄組(A)CO2/H2甲烷生成代謝通路.(B）基因豐度.(C)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)差異.（D）轉(zhuǎn)錄本種類差異分析；RPM,readspermillion.NS,nostatisticalsignificanceinWilcoxonrank-sumtest;*,P<0.05;**,P<0.01;Errorbarsdenotestandarderrors.21研究案例（三）Gut：運(yùn)動可能增加腸道菌群多樣性背景：研究表明，腸道菌群多樣性的減少與肥胖及其他健康問題相關(guān)，而腸道菌群多樣性的增加則有
8、利于新陳代謝和免疫。運(yùn)動可能對腸道菌群的多樣性產(chǎn)生有益影響。Clarke,S.F.,etal.,Exerciseandassociateddietaryextremesimpactongutmicrobialdiversity.Gut,2014.22研究思路平均身體質(zhì)量指數(shù)（BMI），用于衡量體重指標(biāo)，運(yùn)動員組被試的平均身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）是29.1樣本收集：40名專業(yè)橄欖球運(yùn)動員；此外還有23名是正常BMI組（BMI≤25），23名則屬于高BMI組（
