B族鏈球菌核酸檢測試劑盒(PCR熒光探針法).doc

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1、B族鏈球菌（GBS）核酸檢測試劑盒樣本要求1.樣本采集：采用藻酸鈣、普通棉拭子或滌綸拭子采集生殖道或直腸等部位帶上皮細(xì)胞的分泌物標(biāo)本。2．標(biāo)本存放：待測樣本在2-8℃保存不應(yīng)超過24小時；-18℃以下保存不超過4天。樣品凍融6次以內(nèi)無影響，但應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。3．標(biāo)本的運(yùn)輸條件：冷凍4天內(nèi)無影響，冷藏2天內(nèi)無影響。4.含血樣本無法正常檢測應(yīng)避免。5.研究顯示，常用栓劑藥物會對試劑檢測盒造成較大影響，因此取樣前應(yīng)避免該藥物的使用。檢驗方法1.DNA提?。ㄔ跇悠诽幚韰^(qū)操作）（1）妊娠34—37周孕婦生殖道或直腸分泌物：取含有分

2、泌物的生理鹽水1ml，13000rpm離心10min，棄上清液，沉淀，加無菌生理鹽水1ml混勻，13000rpm離心5min，棄上清。沉淀加入50μlDNA提取液充分混勻，99℃—100℃加熱處理10min，13000rpm離心10min，吸取上清至1.5ml離心管中保存，DNA提取完畢。（2）GBS陽性對照品提?。喝?0μlGBS陽性對照品加入1.5ml離心管中，13000rpm離心10min，沉淀加入50μlDNA提取液充分混勻，99℃—100℃加熱處理10min，13000rpm離心10min，吸取上清至1.5ml離心

3、管中保存，DNA提取完畢。（3）空白對照品提?。和珿BS陽性對照品提取。2.GBSPCR反應(yīng)液配制（在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）解凍試劑，在打開蓋子之前振蕩并短暫離心個試劑管。按標(biāo)本數(shù)量分裝GBSPCR反應(yīng)液。按每管35μl分裝至0.2mlPCR反應(yīng)管中，轉(zhuǎn)入樣品處理區(qū)。3.加樣（在樣品處理區(qū)進(jìn)行）分裝好的各反應(yīng)管加入處理好的DNA樣本5μl，陽性對照品5μl及陰性對照品5μl，短暫離心使所有試劑集中到反應(yīng)管底部，確定蓋好管蓋或封膜后，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。4.PCR擴(kuò)增（在PCR檢測區(qū)進(jìn)行）（1）UNG反應(yīng)：50℃2min（2）預(yù)

4、變性：95℃5min（3）PCR：45個循環(huán)；60℃時分別檢測FAM和HEX通道熒光信號，選擇反應(yīng)體系40μl.5.閾值測定閾值設(shè)定在空白對照正常擴(kuò)增區(qū)線下方，基線設(shè)定可選擇3-5個循環(huán)，一般選擇5.00，若是最高濃度Ct值小于5.00，則在3-5之間按照低于最高濃度Ct值設(shè)定；這類標(biāo)本應(yīng)稀釋后再進(jìn)行檢測。6.質(zhì)量控制7.檢測結(jié)果和判定（1）陰性標(biāo)本結(jié)果判定：如果FAM通道無Ct值顯示，而HEX通道信號正常，則樣本為陰性。（2）陽性標(biāo)本結(jié)果判定：a).Ct≤38.00，則樣本為陽性b).若樣本的38.00

5、應(yīng)重試，若結(jié)果仍為38.00