丙型肝炎病毒抗體時間分辨免疫熒光分析及應(yīng)用評價.pdf

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1、第24卷第11期核技術(shù)Vol.24,No.112001年11月NUCLEARTECHNIQUESNovember2001丙型肝炎病毒抗體時間分辨免疫熒光分析及應(yīng)用評價121222肖華龍黃飆朱利國潭成蔡剛明金堅1(江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所附屬江原醫(yī)院無錫214063)2(核醫(yī)學(xué)國家重點實驗室無錫214063)摘要為建立抗-HCV的時間分辨免疫熒光分析法(IFMA),以HCV抗原包被微孔板,樣品中的3+抗-HCV、Eu標(biāo)記羊抗人IgG形成夾心,以β-二酮體為增強(qiáng)液,數(shù)據(jù)采用Log-Logit函數(shù)和四參數(shù)Logistc函數(shù)

2、數(shù)據(jù)處理程序處理。結(jié)果表明,方法的批內(nèi)和批間CV分別為3.64%和4.39%,平均回收率105.58%,可測范圍為1.01—17.34NCU/mL,靈敏度為0.03NCU/mL。本法與HB2sAg有0.23%的交叉,與HBeAg有0.04%的交叉。278例正常對照組血清抗-HCV濃度均小于1NCU/mL。結(jié)果提示,高度靈敏、穩(wěn)定的抗-HCVIFMA方法的建立為臨床和科研工作提供了一種非放射性標(biāo)記定量檢測分析的方法。關(guān)鍵詞抗-HCV,時間分辨免疫熒光分析中圖分類號R446.61抗-HCV是HCV感染機(jī)體后出現(xiàn)的特異

3、性抗體,它是HCV感染和具有一定傳染性的標(biāo)志。由于丙型肝炎可經(jīng)輸血、母嬰垂直傳播、血制品、靜脈用藥、性接觸、體液等多種途徑傳播,且與肝硬化、肝細(xì)胞癌密切相關(guān),因而早期發(fā)現(xiàn)、及早治療,對于控制HCV的傳播,降低其所致丙型肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌具有十分重要的意義。本工作利用時間分辨熒光分析技[1,2]術(shù),建立了抗-HCV抗體時間分辨免疫熒光分析法(IFMA)。1材料與方法1.1材料與試劑HCV抗原(HCVAg)、羊抗人IgG,由上?？迫A公司提供。EuCl3和二乙烯三胺五乙酸(DTPA)為Sigma產(chǎn)品。Sephade

4、xG-50和PD-10柱為Pharmacia產(chǎn)品。發(fā)光增強(qiáng)液和Eu2Cl3標(biāo)準(zhǔn)品為EG&Gwallac產(chǎn)品。牛血清白蛋白(BSA)為衛(wèi)生部上海生物制品所產(chǎn)品。牛γ球蛋白(BIgG)由本實驗室從牛血清中純化制得。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。超純水用美國Barnstead公司生產(chǎn)的D7033超純水器制備。96孔可拆式微孔板條為廈門新創(chuàng)公司產(chǎn)品。HCVELISA試劑盒為上?？迫A公司產(chǎn)品。1.2主要儀器全自動時間分辨熒光檢測儀AUTODELFIA1235為芬蘭EG&GWallac產(chǎn)品,該實驗分析程序軟件由本實驗室自編。酶標(biāo)儀

5、P-450為Bio-Rad產(chǎn)品。1.3HCVAg固相抗原的制備HCVAg用50mmol/LNa2CO3-NaHCO3pH9.6的緩沖液稀釋至10mg/L,在96孔微孔第一作者:肖華龍,男,1961年5月出生,1982年7月畢業(yè)于四川醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生系檢驗專業(yè),主任技師。收稿日期:2000-11-01,修回日期:2001-03-13892核技術(shù)第24卷板上,每孔加入200μL,4℃過夜后沖洗3次。加3g/L的BSA200μL/孔封閉過夜。洗滌后抽干冷凍保存。3+1.4Eu-羊抗人IgG單抗的制備1.4.1環(huán)化DTPA(c

6、DTPA)的合成和鑒定在250mL燒瓶中加入5gDTPA、50mL無水砒啶、5mL乙酐,于65℃N2保護(hù)狀態(tài)下攪拌過夜,過濾,濾餅用無水乙醚洗滌兩次即得。mp-1181-185℃(分解),IR1830cm。1.4.2標(biāo)記化合物的制備分別將羊抗人IgG單抗和cDTPA溶于0.2mol/LNaHCO3和二甲基甲酰胺中備用,濃度為5g/L和20g/L。于尖底玻璃試管中依此加入200μL羊抗人IgG單抗和25μLcDTPA后立即調(diào)pH至8.5,4℃磁力攪拌反應(yīng)4h。反應(yīng)液經(jīng)PD-10柱對生理鹽水交換后,加入30μL33m

7、mol/LEuCl3,室溫反應(yīng)2h,進(jìn)行預(yù)經(jīng)含0.9%NaCl和0.1mL/L的50mmol/LTris-HClpH7.8緩沖液平衡過的SephadexG-50柱層析(1×40cm),紫外A280檢測收集洗脫蛋白峰。1.5IFMA的建立反應(yīng)緩沖液為含0.9%NaCl、0.1%BSA、0.2%BIgG、50μmol/LDTPA和0.1mL/LTween-80的50mmol/LTris-HCl,pH7.8。洗板液為含0.09%NaCl和0.05mL/LTween-80的50mmol/LTris-HCl,pH7.8。在

8、包被有HCVAg的微孔板上每孔分別加入25μL科華公司提供的抗-HCV參考標(biāo)準(zhǔn)、陰陽性對照血清或待測血清樣品。每孔各加入200μL反應(yīng)3+緩沖液,25℃振蕩孵育2h,吸干孔中液體,用洗滌液洗滌4次。每孔加200μL0.5mg/LEu-羊抗人IgG單抗,25℃振蕩孵育0.5h。吸干液體用洗滌液洗滌4次。每孔加發(fā)光增強(qiáng)液200μL,25℃振蕩反應(yīng)5min,檢測熒光強(qiáng)度。以上全