乙型腦炎減毒活疫苗.doc

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1、乙型腦炎減毒活疫苗YixingNaoyanJianduHuoYimiaoJapaneseEncephalitisVaccine,Live本品系用乙型腦炎（簡稱乙腦）減毒株病毒接種于原代地鼠腎細胞，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液、加入適宜穩(wěn)定劑后凍干制成，用于預(yù)防乙型腦炎。1基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原材料及輔料、水、器具、動物等應(yīng)符合“凡例”有關(guān)要求。2制造2.1生產(chǎn)用細胞生產(chǎn)用細胞為原代地鼠腎細胞或連續(xù)傳代不超過5代的地鼠腎細胞。2．1．1細胞管理及檢定應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)和檢定用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”規(guī)定。2.1.2細胞制

2、備選用10～14日齡清潔地鼠，無菌取腎，剪碎，經(jīng)胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)液分散細胞，制備細胞懸液，分裝培養(yǎng)瓶，置37±1℃培養(yǎng)。細胞生長成致密單層后接種病毒。來源于同一批地鼠、同一容器消化制備的地鼠腎細胞為一個細胞消化批。源自同一批地鼠、于同一天制備的多個細胞消化批為一個細胞批。2.2毒種2.2.1名稱及來源生產(chǎn)用毒種為乙腦病毒SA14-14-2減毒株。2.2.2種子批的建立應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)和檢定用菌毒種管理規(guī)程”規(guī)定。原始種子批傳代應(yīng)不超過第6代，主種子批應(yīng)不超過第8代，工作種子批應(yīng)不超過第9代,生產(chǎn)的疫苗應(yīng)不超過第1

3、0代。2.2.3種子批的檢定主種子批應(yīng)進行以下全面檢定，工作種子批至少應(yīng)進行2.2.3.1~2.2.3.4項檢定。2.2.3.1鑒別試驗取毒種做10倍系列稀釋，取適宜稀釋度分別與非同源性乙腦特異性抗體和乙腦陰性血清混合，置37℃作用90分鐘，分別接種地鼠腎單層細胞或BHK21細胞進行中和試驗，觀察5～7天判定結(jié)果。中和指數(shù)應(yīng)大于1000。2.2.3.2病毒滴定取毒種作10倍系列稀釋，至少取3個稀釋度的病毒液，分別接種BHK21細胞，用蝕斑法進行滴定。凍干種子批病毒滴度應(yīng)不低于應(yīng)5.7LgPFU/ml；液體種子批病毒滴度應(yīng)

4、不低于7.2LgPFU/ml。2.2.3.3無菌檢查依法檢查（附錄XIIA），應(yīng)符合規(guī)定。2.2.3.4支原體檢查依法檢查（附錄XIIB），應(yīng)符合規(guī)定。2.2.3.5病毒外源因子檢查依法檢查（附錄XIIC），應(yīng)符合規(guī)定。2.2.3.6E蛋白基因穩(wěn)定性試驗以E蛋白基因區(qū)核苷酸序列測定驗證其遺傳穩(wěn)定性。編碼E蛋白基因區(qū)的8個關(guān)鍵位點氨基酸不能發(fā)生改變（E-107：苯丙氨酸,E-138：賴氨酸，E－176：纈氨酸，E－177：丙氨酸，E－264：組氨酸，E－279：蛋氨酸，E－315：纈氨酸，E－439：精氨酸）。與基因庫中登

5、錄號為D90195的乙型腦炎減毒株SA14－14－2株的E蛋白基因區(qū)核苷酸序列的同源性不低于99.6%。2.2.3.7免疫原性檢查用主種子批制備疫苗，取10-3、10-4、10-5至少3個稀釋度，分別免疫體重為10～12g小鼠10只，每只皮下注射0.1ml，免疫1次。免疫后14天用P3株乙腦強毒腹腔攻擊，每只注射0.3ml，其病毒量應(yīng)不低于500腹腔滴定的LD50。同時每只小鼠腦內(nèi)接種稀釋液0.03ml。攻擊后14天判定結(jié)果。ED50應(yīng)不高于3.0LgPFU，攻擊對照組小鼠死亡率應(yīng)不低于80%。2.2.3.8猴體神經(jīng)毒力

6、試驗用凍干主種子批進行猴體神經(jīng)毒力試驗。將主種子批毒種（病毒滴度不低于5.7LgPFU/ml），分別注射10只恒河猴的兩側(cè)丘腦各0.5ml和腰部脊髓內(nèi)0.2ml。對照組用強毒SA14株稀釋成102PFU/ml和103PFU/ml病毒量,以同法接種猴子，每個稀釋度注射4只猴子，注射部位同試驗組。對SA14-14-2減毒株組的10只猴子觀察至少21天，應(yīng)無任何特異性乙腦發(fā)病癥狀，組織學檢查僅表現(xiàn)為注射部位、腦和脊髓有輕微的炎癥反應(yīng)。而對照組SA14株在注射后8天內(nèi)病毒量103PFU/ml組4只猴子應(yīng)全部死亡；病毒量為102P

7、FU/ml組的4只猴子，至少應(yīng)有2只猴子死亡。組織學檢查表現(xiàn)主要特征為神經(jīng)細胞壞死，較少炎癥反應(yīng)。2.2.3.9腦內(nèi)致病力試驗用種子批毒種接種體重為12～14g小鼠，至少10只，每只腦內(nèi)注射0.03ml，觀察14天應(yīng)活存。接種后3天內(nèi)死亡者不計，但3天內(nèi)死亡數(shù)不得超過20%。3天后如有小鼠發(fā)病，應(yīng)處死后取腦，測定致病力。小鼠腦內(nèi)毒力應(yīng)不高于3.0LgLD50/0.03ml，同時以10-1病鼠腦懸液皮下注射體重為10～12g小鼠10只，每只0.1ml，觀察14天，應(yīng)全部健存。2.2.3.10皮下感染入腦試驗用種子批毒種接種

8、體重為10～12g小鼠10只，每只皮下注射0.1ml，同時右側(cè)腦內(nèi)空刺，觀察14天，應(yīng)全部健存。2.2.3.11乳鼠傳代返祖試驗用病毒滴度不低于7.2LgPFU/ml(液體毒種)或不低于5.7PFU/ml(凍干毒種)的種子批毒種接種3～5日齡乳鼠10只，每只腦內(nèi)注射0.02ml。將發(fā)病的乳鼠處死3只，解剖取腦，用體重