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《鋅指蛋白在各個(gè)組織中表達(dá)量的測(cè)定.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、印記基因的鑒定及功能分析----鋅指蛋白在各個(gè)組織中表達(dá)量的測(cè)定生物技術(shù)孫業(yè)潤(rùn)（1092810108）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模鹤哌M(jìn)實(shí)驗(yàn)室了解基本實(shí)驗(yàn)儀器，練習(xí)對(duì)各種儀器的使用;學(xué)習(xí)PCR原理，掌握PCR操作;通過電泳對(duì)DNA進(jìn)行分析;探究鋅指蛋白在不同組織中的表達(dá)量對(duì)比。實(shí)驗(yàn)原理：1，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，簡(jiǎn)稱PCR）又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火(復(fù)性）--延伸
2、三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至40~60℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火-
3、-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。2，NDA凝膠電泳：NDA凝膠電泳是常用的用于分離鑒定DNA,RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂糖作為支持物，利用DBA分子在涌動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電勢(shì)點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的移動(dòng)速度
4、與其相對(duì)分子質(zhì)量成反比，當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠（EB）染色，在紫外燈光下可以檢測(cè)出DNA條帶，從而確定DNA片段在凝膠中的位置。與通過marker比較可進(jìn)行更加深入的研究3，通過比較不同組織cDNA中鋅指蛋白基因PCR后DNA帶的亮度來確定表達(dá)量的多少，但是DNA多也可能是因?yàn)槟０逯锌赡艽嬖谥貜?fù)的編碼序列即基因的初始濃度高，所以要通過內(nèi)參基因（在不同組織中表達(dá)穩(wěn)定的基因）來確定待測(cè)基因的初始濃度。4,鋅指基序（zincfingermotif）。許多轉(zhuǎn)錄因子中都含有鋅指基序。這些蛋白通常含有多個(gè)指狀結(jié)構(gòu)可以
5、插入靶DNA序列的大溝中。許多鋅指蛋白的比較表明，基序?yàn)槎喾N氨基酸序列提供了各種識(shí)別DNA序列結(jié)構(gòu)的框架。實(shí)驗(yàn)材料及儀器：DNA凝膠電泳：材料：瓊脂糖，電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），儀器：微波爐，電泳槽PCR:材料：dNTP，腦舌心肝肺胎盤的cDNA鋅指蛋白引物，內(nèi)參基因引物，酶，水，鎂離子儀器：PCR儀，PCR管其他儀器：微量移液器，簡(jiǎn)要離心機(jī)，漩渦混合儀等一些實(shí)驗(yàn)儀器的使用方法:1微量移液器，可以準(zhǔn)確吸取少量的液體。一個(gè)完整的移液過程包括：1)容量設(shè)定2)安裝移液頭3)吸液先將移液器排放按鈕按至第一停點(diǎn)，再將吸
6、液頭垂直浸入液面。盡量避免吸液頭浸入液面過深，以免液壓對(duì)吸液的精確度造成影響。同時(shí)可以避免在吸取粘稠液體時(shí)在吸液頭表面粘上液體影響吸取精度。松開移液器排放按鈕要平穩(wěn)，切記不能過快，以免導(dǎo)致液體吸入移液器內(nèi)部。4)排液排液時(shí)，吸液頭緊貼容器壁，先將排放按鈕按至第一停點(diǎn)，略作停頓以后，再按至第二停點(diǎn)，這樣做可以確保吸液頭內(nèi)無殘留液體。5)卸去移液頭一般用力下按吸液頭推出器即可卸掉吸液頭。6)如不使用，將移液器調(diào)到最大量程。2簡(jiǎn)要離心機(jī)，經(jīng)過簡(jiǎn)要離心，粘在容器壁上的液體會(huì)被離心到底部，方便吸取3漩渦混合儀，混合，混勻液體
7、。微量移液器（也稱槍）漩渦混合儀實(shí)驗(yàn)步驟：1配置10mlPCR體系按如下反應(yīng)體系逐步加入各反應(yīng)試劑：ComponentsVolumeFinalConcentrationddH2Otofinalvolume10μlNotapplicable10×EasyTaqBuffer(含Mg2+)1μl1×25mMdNTPs0.8μl0.2mMForward+ReversePrimer(5μMeach)1μl0.2eachEasyTaqDNAPolymerase0.05μl2.5units1*cDNATemplate1μlasr
8、equired2使用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增按以下程序設(shè)定PCR反應(yīng)程序：94℃2-5min94℃30sec50-60℃30sec25-35cycles72℃1min/1-2kb72℃5-10min16℃∞3配置瓊脂糖凝膠1）用自來水或蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，將制膠板放入膠槽中；2）根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準(zhǔn)確稱量瓊脂糖
