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1、棒狀體相關(guān)蛋白1原核表達(dá)免疫熒光定位免疫反應(yīng)原性論文【提示】本文僅提供摘要、關(guān)鍵詞、篇名、目錄等題錄內(nèi)容。為中國(guó)學(xué)術(shù)資源庫(kù)知識(shí)代理，不涉版權(quán)。作者如有疑義，請(qǐng)聯(lián)系版權(quán)單位或?qū)W校。【摘要】東方巴貝斯蟲(Babesiaorientalis,簡(jiǎn)稱：B.o)是一種由鐮形扇頭蜱經(jīng)卵傳播的血液原蟲,主要引起水牛發(fā)病,臨床癥狀以高熱,貧血,黃疸,消瘦和血紅蛋白尿等為特征,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致水牛死亡。東方巴貝斯蟲的發(fā)現(xiàn)到目前已經(jīng)有二十多年,盡管對(duì)其形態(tài)學(xué)、流行病學(xué)、生活史、分子分類和診斷技術(shù)等方面進(jìn)行了詳細(xì)的研究,但關(guān)于該病原的入侵機(jī)制以及候選疫苗篩選等方面的研究仍然有限。因此,本研究在建立的東方巴貝
2、斯蟲基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上,克隆與蟲體入侵相關(guān)的棒狀體相關(guān)蛋白I(RAPl)基因,對(duì)其進(jìn)行氨基酸序列和進(jìn)化分析,隨后對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)及免疫熒光定位,從而為闡明東方巴貝斯蟲的入侵和免疫機(jī)制提供依據(jù)。(1)東方巴貝斯蟲RAPl基因克隆及其結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)根據(jù)從數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的東方巴貝斯蟲RAPl基因的相關(guān)信息設(shè)計(jì)一對(duì)特異性的引物RAP1-F/RAP1-R,從東方巴貝斯蟲基因組擴(kuò)增到一條1732bp的包含RAPl基因全長(zhǎng)的序列。基因序列分析表明其包含一個(gè)1434bp的ORF,編碼477個(gè)氨基酸。同源性分析表明,此蛋白基因序列與羊巴貝斯蟲RAPl(BabesiaovisRAP1)基因(GenBank
3、序列號(hào)：M91173.1)的第二個(gè)CDS序列同源性最高為71%；與牛巴貝斯蟲(Babesiabovis;AF030058.1)、駑巴貝斯蟲(Babesiacaballi;AB017700.1)、犬巴貝斯蟲(Babesiacanis;M91168.1)的同源性分別為68%、63%和64%。預(yù)測(cè)的氨基酸序列與牛巴貝斯蟲(GenBank序列號(hào)：AAB84268.1)的同源性最高為58%；與羊巴貝斯蟲(AAA27805.1)、駑巴貝斯蟲(ADF30793.1)、犬巴貝斯蟲(AAA27807.1)的同源性分別為43%、48%和42%。RAPl氨基酸序列的進(jìn)化分析表明東方巴貝斯蟲是歸屬于巴
4、貝斯蟲的一個(gè)獨(dú)立的新種。結(jié)構(gòu)分析表明,它具有巴貝斯蟲RAPl基因家族所特有的一些氨基酸結(jié)構(gòu)特征,如N末端具有一個(gè)17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽；四個(gè)保守半胱氨酸殘基；十四個(gè)氨基酸保守基序；前300個(gè)氨基酸的一些保守的基序以及C末端的5個(gè)串連的重復(fù)區(qū)域等。(2)東方巴貝斯蟲RAPl原核表達(dá)、免疫定位及免疫反應(yīng)原性根據(jù)RAPl基因的序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn),其主要的預(yù)測(cè)功能位點(diǎn)都處在N末端的前三百個(gè)氨基酸內(nèi),本研究將克隆的東方巴貝斯蟲RAPl開放閱讀框全長(zhǎng)(RAPl-F)和N末端834bp片段(RAP-N)連接到原核表達(dá)載體pGEX-KG,成功的構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-RAP1-F和pGEX-
5、KG-RAP1-N。利用原核表達(dá)所得的重組蛋白GST-RAP1-F和GST-RAP1-N免疫新西蘭白兔成功的制備了多克隆抗體。利用東方巴貝斯蟲感染水牛陽(yáng)性血清的Western-blot分析表明,GST-RAP1-F和GST-RAP1-N都具有良好的反應(yīng)原性。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明東方巴貝斯蟲RAP1定位在紅細(xì)胞內(nèi)的蟲體表面。本實(shí)驗(yàn)成功的克隆了東方巴貝斯蟲RAP1基因,其基因序列與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析為進(jìn)一步證明東方巴貝斯蟲為獨(dú)立新種提供了有力的依據(jù)；免疫熒光定位實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)東方巴貝斯蟲RAP1也與蟲體入侵宿主紅細(xì)胞相關(guān)；原核表達(dá)的結(jié)果為我們預(yù)防控制東方巴貝斯蟲病提供了一定的理論基礎(chǔ)?！娟P(guān)
6、鍵詞】東方巴貝斯蟲；棒狀體相關(guān)蛋白1；原核表達(dá)；免疫熒光定位；免疫反應(yīng)原性；【篇名】東方巴貝斯蟲棒狀體相關(guān)蛋白1（RAP1）基因克隆及免疫特性研究【目錄】東方巴貝斯蟲棒狀體相關(guān)蛋白1（RAP1）基因克隆及免疫特性研究摘要6-8ABSTRACT8-9縮略語(yǔ)表10-121巴貝斯蟲入侵相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展12-191.1引言121.2巴貝斯蟲入侵相關(guān)蛋白12-181.2.1GPI錨定裂殖子表面抗原(MSA)12-131.2.2棒狀體相關(guān)蛋白1(RAP1)13-141.2.3頂膜抗原1(AMA1)14-151.2.4凝血酶敏感蛋白相關(guān)黏附蛋白(TRAPs)15-161.2.5球狀體蛋白(
7、SBPs)16-171.2.6多變紅細(xì)胞表面抗原1(VESA1)17-181.3小結(jié)與展望18-192研究目的與意義19-203材料與方法20-323.1試驗(yàn)材料20-253.1.1載體與質(zhì)粒20-213.1.2菌株、蟲株、血清和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物213.1.3主要藥品、試劑及儀器21-223.1.4抗生素與培養(yǎng)基223.1.5質(zhì)粒提取緩沖液22-233.1.6SDS-聚丙烯酰胺凝膠電流(SDS-PAGE)緩沖液233.1.7Westernblot緩沖液233.1.8其它緩沖液及溶液23-253.2試
