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1、第九講蛋白質(zhì)的修飾與克隆表達 （二）第一節(jié)蛋白質(zhì)的化學修飾第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子生物學改造第三節(jié)蛋白質(zhì)(基因)的克?。ㄅc）表達蛋白質(zhì)化學修飾——復習蛋白質(zhì)化學修飾的目的和意義？蛋白質(zhì)化學修飾的主要部位是什么？什么是位點專一性修飾？親和標記及其分類，與競爭性可逆作用的主要區(qū)別是什么？肽鏈中出現(xiàn)切開，蛋白質(zhì)三維結構和生物活性還能保持嗎？若變性和復性會發(fā)生什么現(xiàn)象，這一現(xiàn)象有何意義。提高蛋白質(zhì)藥物體內(nèi)穩(wěn)定性的策略。化學修飾？如何修飾？舉例說明第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子生物學改造基因突變技術基因融合技術為什么要進行蛋白質(zhì)改造？理論上，針對蛋白一級結構—高級結構—生物功能關系
2、問題應用上，針對蛋白質(zhì)生物進化的適應性和生物活性的問題。工業(yè)用酶：體外穩(wěn)定性差，易失活。高溫、高壓、有機溶劑環(huán)境活性低、易失活醫(yī)用：抗原性、過敏反應、體內(nèi)半衰期短等等因此，需要對蛋白進行改造，在理論上和實踐上具有重要意義。為什么要利用分子生物學改造化學合成，尤其是批量人工合成蛋白，造價高成本大，很難滿足研究和生產(chǎn)需要。生物體蛋白質(zhì)合成的中心法則：基因→轉錄→翻譯→蛋白質(zhì)20th70S以來，PCR技術和DNA重組技術建立和發(fā)展，基因工程廣泛應用，以及基因突變等基因改造技術的發(fā)展；（關鍵技術）分子生物學技術，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)改造的有力工具，并形成一整套的技術，
3、具有其獨特的優(yōu)勢。(基因的克隆、篩選、表達)優(yōu)勢：通過改變遺傳密碼。在一級結構上，能夠隨心所欲地改造蛋白質(zhì)。在實踐上已充分證實，并有許多成功的實例和借鑒，方法簡便、易行。DNA合成的造價遠遠低于蛋白質(zhì)的合成，當代，基因的合成已不是問題。蛋白質(zhì)分子生物學改造的策略——經(jīng)驗熱穩(wěn)定提高，有助于耐有機溶劑、極端pH分子中引入適當?shù)亩蜴I，顯著提高穩(wěn)定性在高溫下，蛋白質(zhì)Gln、Asn脫氨，影響生物功能，替換成其他合適的氨基酸。原核生物表達真核基因，重組蛋白表達高，但活力低——替換重組多肽中多余的Cys，降低錯誤折疊的可能性，提高表達產(chǎn)物的生物活性。提高酶催化活性根
4、據(jù)酶活性中心結構參數(shù)和催化反應機理，替換個別氨基酸殘基，隨機改造肽段，或刪除末端氨基酸序列等。消除酶被抑制特性序列，強化配體—受體的親和性，改善酶的催化特性。異源蛋白質(zhì)藥物，導致過敏——構建（人—鼠）嵌合基因，表達嵌合抗體，減少藥物的抗原性。蛋白質(zhì)基因改造方法：采用現(xiàn)代分子生物學技術——主要包括3種基因突變、基因融合、摻入非天然氨基酸等。以下簡單介紹這三種技術，本節(jié)要求掌握前2種技術一、基因突變技術1、什么是？在基因水平上對其編碼蛋白質(zhì)分子的基因進行改造，通過其表達產(chǎn)物，來研究蛋白質(zhì)結構和功能，或得到優(yōu)良蛋白質(zhì)分子菌種的分子生物學技術。2、技術先進性可稱
5、為：蛋白質(zhì)結構—功能關系研究的革命性變化；隨心所欲、方便地研究特定氨基酸殘基、特定結構單元，在蛋白質(zhì)結構形成和功能表達中的作用；創(chuàng)造新型具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子，滿足應用的需要。3、類型（2種）定點突變和定向進化3、基因突變的分類基因突變定點突變（位點特異性）定向進化（隨機突變）理性化設計非理性化設計3.1定點突變（sitedirectedmutagenesis）如何理解？在基因水平上，將DNA序列（基因）中某一特定位點堿基進行改變的分子操作技術。進一步理解取代、插入或刪除——已知DNA序列中——特定的核苷酸，表達蛋白質(zhì)結構中個別aa殘基變化的——分子操
6、作技術。理性分子設計？定點誘變技術用來對蛋白質(zhì)（酶）分子重新設計并改造其物理化學性能，同時可以進行酶分子的構象-功能相互關系的研究。在已知蛋白結構和功能基礎上，有目的、有計劃地設計和改變蛋白分子中某一活性基團和模塊，從而產(chǎn)生新性狀分子。因此稱理性分子設計。特點：與物理、化學等自然因素誘變方法相比突變位點清楚、突變率高、簡單易行、重復性好（1）定點突變的方案設計（一）定點突變設計和選擇——突變aa或突變的bpDNA模板的制備——目的基因寡核苷酸突變位點的引物的設計和選擇突變堿基的導入目的基因——PCR反應等方法反應條件選擇和優(yōu)化DNA聚合酶的選擇dUTP對
7、基因合成反應的影響目的基因表達突變體的篩選及影響因素突變蛋白分離、純化、功能測定簡單介紹4種基本方法理解突變方案的設計Kunkel突變法基于抗生素抗性“回復”突變的方法基于去除特定限制酶切位點的突變方法基于聚合酶鏈式反應（PCR）的突變方法（2）定點突變的方法——簡單介紹4種Kunkel突變法（試劑盒）制備U單鏈設計思路？制備目的基因模板導入突變堿基合成突變基因篩選突變基因PCRM13噬菌體設計思路Note：E.Coli菌株缺陷型(dut-ung-)dut-：dUTP酶ung-：尿嘧啶-N-糖基化酶問題：缺陷型？野生型？噬菌斑？關鍵步驟——制備含U目的基
8、因單鏈DNA模板基于抗生素抗性“回復”的突變方法制備和篩選目的基因Promega
